倪建?！W巧明　令利軍　葉春雷　王亞馥　邢更妹　李　杉　崔凱榮　武祿光

摘要將高粱總DNA通過(guò)花粉管通道導(dǎo)入小麥感病品種甘麥8號(hào)，D₂代出現(xiàn)2株對(duì)條銹病免疫的變異株，D₅代有9個(gè)株系抗性已經(jīng)穩(wěn)定；用混合菌和分小種鑒定，對(duì)條中29、30、洛13Ⅱ、水14、水14中梁17-s、HY3、條中31號(hào)等小種表現(xiàn)免疫。結(jié)果分析表明，新品系89144接種后組織中SOD活性升高，原受體甘麥8號(hào)接種銹菌后SA含量也有升高；但并不伴隨有CAT活性下降，SOD活性和H₂O₂含量的升高；推測(cè)5A為CAT過(guò)氧化活性提供一個(gè)電子的過(guò)程中SA含量必須達(dá)到一定的閾值，并且與CAT的時(shí)序調(diào)節(jié)相配合；據(jù)SA結(jié)合態(tài)和游離態(tài)含量的變化動(dòng)態(tài)，表明89144具有SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑，推測(cè)SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的上游應(yīng)該還有一些機(jī)制在起作用。

關(guān)鍵詞植物病理學(xué)：小麥條銹??；抗銹新品系

中圖分類號(hào)S435.121．42

小麥條銹病(Puccinia striiformis f.sp.triti-ci)是甘肅省小麥主要病害之一，嚴(yán)重影響小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外研究和生產(chǎn)實(shí)踐證明，選育抗銹病品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。為了培育新的抗銹品種，從1988年起，在總結(jié)以往工作的基礎(chǔ)上開(kāi)展了應(yīng)用花粉管通道法將外源C₄作物高粱DNA向小麥轉(zhuǎn)移的探索，1989年在大田和溫室共做了80個(gè)外源DNA導(dǎo)人組合，獲得抗條銹病新品系89144，并對(duì)其后代材料作了較系統(tǒng)的觀察和研究。本文報(bào)道小麥抗條銹新品系主要特征和抗性生理生化變化進(jìn)行比較測(cè)定和分析。

1材料和方法

1．1材料

受體為普通小麥(Triticum sestrvum)，品種甘麥8號(hào)，株高107cm左右，穗型棍棒狀、頂芒、生育期104d，適應(yīng)性強(qiáng)，曾大面積種植，現(xiàn)重感條銹??；供體為高粱[Sorghumbicolor(L.)]品種米高粱，抗旱、耐澇、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)。

1．2方法

1.2.1DNA提取和導(dǎo)入

供體高梁DNA提取和導(dǎo)人參照倪建福等方法。

1．2．2田間資料統(tǒng)計(jì)與觀察

經(jīng)處理的當(dāng)代受體記作D_O，其后代依次記為D₁、D₂和D₃等。D_O～D₁按組合收種子，以后按系譜法選擇，等抗性穩(wěn)定后再按組合收種子，種植按行長(zhǎng)1．20m、行距0．20m、粒距0．04 m點(diǎn)播，田間觀察和室內(nèi)外考種項(xiàng)目按常規(guī)育種要求進(jìn)行，各種材料按種植小區(qū)和株系收獲。

1．2．3抗銹性鑒定

除本中心每年用心葉涂抹法接種流行混合菌選擇外，對(duì)獲得的抗銹新品系再送甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所進(jìn)行專門鑒定，反應(yīng)型按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)匯載。

1．2．4種子粗蛋白和淀粉含量的測(cè)定

抗銹新品系89144和供、受體一并送測(cè)試中心，按照國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。粗蛋門是將材料先采用凱氏法處理后，用瑞典Tecalor公司的Kielteasystem Ⅱ氮／蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定；賴氨酸采用國(guó)際染料結(jié)合法(PBL法)染色，再用北京環(huán)保儀器廠的GXDL。－202型蛋白質(zhì)賴氨酸分析儀測(cè)定；淀粉采用國(guó)際旋光法測(cè)定”。

1．2．5水楊酸(psalicylicacid，SA)含量的測(cè)定

將小麥種子浸種后，播種于塑料缽蛭石內(nèi)，在小麥一葉展葉時(shí)利用心葉涂抹法接人小麥條銹菌混合菌種，培養(yǎng)溫度13～19℃．光照12h／d，濕度100％，接種后24、32、40、48、56 h取材。參考李兆亮等方法用硅膠板純化粗提液，用HPLC(儀器型號(hào)Waters^TM600EC－18柱)檢測(cè)樣品中SA含量，檢測(cè)溫度40℃，流速為0．6 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm，保留時(shí)間4．05 min。

1．2．6過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定

取0．5g葉片加1．8mL預(yù)冷的提取緩沖液(10 mmoI／L Tris-HCl pH7．5，0．25 mol／L蔗糖，1 mmol／L EDTA，10．5 mmol／L DTT，0．1 mmol／LPMSF)，研磨成勻漿后在4℃條件下27000g離心15min，上清液按崔凱榮方法測(cè)定酶活性。

1．2．7過(guò)氧化氫(H₂O₂)含量的測(cè)定

取1g葉片參考Patterson等方法加3mL冷丙酮磨成勻漿，16000g離心10 min，上清液定容，反應(yīng)液中含0．1mL體積分?jǐn)?shù)20％TiCL₄的濃鹽酸，0．2 mL濃氨水和1mL。上清液。生成的過(guò)氧化物-Ti復(fù)合物用丙酮洗5次．丙酮揮發(fā)后溶于3mL。硫酸(1mol／L)中，測(cè)410nm光吸收值，制作H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．8超氧化物岐化酶(SOD)活性的測(cè)定

取0．5g葉片加1，8 mI。預(yù)冷的提取緩沖液(50mmol／LpH7．8磷酸緩沖液，0．1 mmol／LED-TA，體積質(zhì)量0.3％TritonX-100；體積質(zhì)量4％聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)研磨后用紗布過(guò)濾，10500g離心20 min，上清液為粗酶液。按照EL-moshaty等方法測(cè)定SOD活性，根據(jù)SOD抑制NBT光化學(xué)還原的量計(jì)算酶活性。

1．2．9過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定

取0．5g葉片參考崔凱榮等方法加1.8 mL預(yù)冷的提取緩沖液(100mmol／LPBS，pH6．0．內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0．1％TritonX-100和體積質(zhì)量0．04％偏重亞硫酸鈉。冰浴研磨，14 000 S離心15 mln。以愈創(chuàng)木酚作底物，在470 nm處測(cè)OD值。以△OD／min·mg蛋山為酶活單位。

2結(jié)果與分析

2．1生物學(xué)特性

1989年將高梁DNA通過(guò)花粉管通道導(dǎo)入小麥感病品種麥8號(hào)，共處理小花或子房134個(gè)，獲得D_o代種子28粒，結(jié)實(shí)率為20．90％。1990年點(diǎn)播成苗27株；1991年種植900株，從中選出2株變異株；1992年從中選1株種子點(diǎn)播；1993年種植l800株．獲得變異株121株；1994年種植1140株，入選41株；1995年種植1800株，從中選出穩(wěn)定遺傳的抗銹新品系89144系列，其生物學(xué)特性，見(jiàn)表1。

兩個(gè)抗銹新品系的大多數(shù)生物學(xué)性狀是介于受體和供休之間，如葉功能期延長(zhǎng)，株高降低，穗長(zhǎng)和粗蛋白增加以及千粒重、賴氨酸和淀粉含量等均介于供體和受體之間，但籽粒飽滿度增加，小穗排列疏松，葉片變窄變長(zhǎng)，穎殼變硬(表2)。

抗銹性鑒定結(jié)果表明，兩個(gè)抗銹新品系89144

對(duì)目前流行的所有小種免疫，特別是在近年甘肅生產(chǎn)上應(yīng)用的所有小麥品系幾乎對(duì)條中3l和32號(hào)喪失抗性的情況下，89144仍然抗銹，與其雜交的組合后代也非?？逛P，見(jiàn)表2。

2．2水楊酸含量變化

在接種條銹菌后，通過(guò)HPLC測(cè)定結(jié)合態(tài)與游離態(tài)SA含量變化結(jié)果如圖l、2?？逛P新品系89144游離態(tài)水楊酸從32 h開(kāi)始逐漸升高，40 h達(dá)到峰值，然后丌紿緩慢下降，到48h急劇下降。甘麥8號(hào)從24h開(kāi)始緩慢上升，上升幅度比89144小2倍，到32 h快速下降，而在未接種銹菌的對(duì)照中，89144和甘麥8號(hào)內(nèi)源游離SA含量變化都不大。圖2表明，接種后89144、甘麥8號(hào)的結(jié)合態(tài)SA含量都有上升，并且甘麥8號(hào)比89144上升幅度大而且時(shí)間早。在對(duì)照中，89144、甘麥8號(hào)的結(jié)合態(tài)SA含量變化不大。

2．3過(guò)氧化氫酶活性變化

由圖3可以看出，抗銹新品系89144的CAT活性在接種條銹菌40h處開(kāi)始大幅度下降，48h后又略有回升，而甘麥8號(hào)變化不大。對(duì)照未接種條銹菌的89144、甘麥8號(hào)，CAT活性變化不大。

2．4過(guò)氧化氫含量變化

圖4表明，在接種銹菌48 h后，抗銹新品系89144中H₂O₂含量達(dá)到峰值，甘麥8號(hào)含量也略有升高，而對(duì)照89144、甘麥8號(hào)H₂O₂含量變化不大。

2．5超氧化物歧化酶活性變化

圖5表明，抗銹新品系89144在接種后40h，SOD活性開(kāi)始增高，到48h達(dá)到峰值，而后迅速下降。甘麥8號(hào)接種后32h開(kāi)始緩慢增高，但增高幅度不大。而在對(duì)照89144和甘麥8號(hào)的SOD酶活性變化都不明顯。

2．6過(guò)氧化物酶活性變化

圖6中抗銹新品系POD酶活性無(wú)論在接種條件下還是在未接種條件下變化都不大，只是在接種56 h后抗銹新品系89144的POD活性稍有升高。

3討論

經(jīng)多年實(shí)踐表明，利用花粉管通道將外源DNA導(dǎo)入小麥胚囊，轉(zhuǎn)化上不具備正常細(xì)胞壁即合子或早期細(xì)胞是完全可行的，因?yàn)镈NA片斷與受體基因組部分基因間有可能存在同源性而發(fā)生雜交重組。該技術(shù)之所以提高選育出抗銹品系的成功率，是因?yàn)楣w一方的染色體經(jīng)提取后片斷變小，從而減少了整條染色體之間的排斥性，增加了部分染色體重組幾率。

實(shí)驗(yàn)研究顯示，外源DNA導(dǎo)入后代抗銹新品系89144在接種銹菌40h后，內(nèi)源游離SA含量達(dá)到峰值，從40 h至48 h有一個(gè)緩慢下降階段，同時(shí)伴隨著CAT活性降低，H₂O₂含量增加，SOD活性增高。而不抗銹品種甘麥8號(hào)在接種銹菌后，也有內(nèi)源游離SA含量升高，但并不伴隨有CAT活性下降和SOD、POD活性升高，也沒(méi)有H₂O₂含量的上升。Chen等曾研究證明煙草中的SA結(jié)合蛋白(SA—bindingprotem，SABP)具有CAT活性，可以降解H₂O₂產(chǎn)生O₂和H₂O，SA阻遏SABP的CAT活性，SA作為電子供體為CAT的過(guò)氧化活性提供一個(gè)電子，同時(shí)抑制并使這些酶處于不活躍狀態(tài)，從而導(dǎo)致H₂O₂含量升高。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出雖然抗銹新品系89144和甘麥8號(hào)接種銹菌后，SA含量都有升高，但甘麥8號(hào)H₂O₂含量達(dá)到峰值的時(shí)間早，峰值低，這可能是因?yàn)镾A為CAT過(guò)氧化活性提供一個(gè)電子的過(guò)程中SA的量必須達(dá)到一定的閾值，并且與CAT的時(shí)序調(diào)節(jié)相配合。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，甘麥8號(hào)、抗銹新品系89144接種銹菌后游離SA含量增高，結(jié)合態(tài)SA含量也升高，所以在誘導(dǎo)條件下游離SA含量的升高不一定來(lái)自于結(jié)合態(tài)SA的釋放，還可能是植物體內(nèi)與SA合成的相關(guān)基因被啟動(dòng)。這樣，在SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的上游就還有某些機(jī)制在起作用?？逛P新品系89144接種銹菌后SOD活性也有升高，SOD可使O₂通過(guò)歧化反應(yīng)產(chǎn)生H₂O₂，在正常條件下，植物體中的SOD活性足以清除體內(nèi)的O₂，使O₂保持在正常生理水平。但在逆境條件下，O₂水平的提高刺激了SOD活性的增加，這可能與病原物誘導(dǎo)的氧化噴發(fā)有關(guān)。但在實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)POD活性的大幅度變化，也許在檢測(cè)時(shí)POD活性已恢復(fù)常態(tài)，這也符合氧化噴發(fā)的時(shí)相。由此推測(cè)在植物體內(nèi)H₂O₂含量升高可以通過(guò)多種途徑造成，Chen等的實(shí)驗(yàn)也證明H₂O₂或它的衍生物活性氧可激活抗病反應(yīng)途徑中相關(guān)基因表達(dá)。