明艷林　鄭國華

摘要以蔓陀羅為建蘭花葉病毒(cyMV)廈門分離物的繁殖寄主。通過一次差迷離心、一次PEG沉淀結(jié)合超速離心提純建蘭花葉病毒，病毒得率約400 mg／kg。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的建蘭花葉病毒外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以該病毒RNA及病葉總RNA為模板，建立了建蘭花葉病毒RT-PCR快速檢測體系，其檢測靈敏度可達(dá)1．o Pg病毒和11mg／mL的病葉組織。

關(guān)鍵詞植物病理學(xué)；建蘭花葉病毒；RT-PCR；檢測

中圖分類號S 436．8

建蘭花葉病毒屬馬鈴薯X病毒屬(Potxvirus)，線狀，長約475nm，寬約12nm，病毒核酸為ssRNA。CyMV是迄今已報(bào)道從蘭花上分離到的25種病毒中分布最廣、危害最嚴(yán)重的種類之一，世界各蘭花產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。我國海南和廣東等地都已分離鑒定了CyMV分離物，并對該病毒的基因組及其檢測方法進(jìn)行了研究。美國、新加坡、韓國從本地栽培蘭花中分離鑒定出CyMV，并就其病原學(xué)和分子生物學(xué)等方面進(jìn)行了廣泛的研究。研究表明，不同的CyMV分離物之間存在較大的株系差異。

近午來．廈門地區(qū)蘭花種植區(qū)的蝴蝶蘭上嚴(yán)重發(fā)生病毒病，田間病株葉片上有明顯的花葉癥狀，嚴(yán)重時(shí)葉片發(fā)育受阻，呈畸形，花朵小且色澤不鮮，產(chǎn)量質(zhì)量都受到影響。作者曾從感病蝴蝶蘭病株中分離鑒定CyMV分離物，本文報(bào)道該病毒分離物的精提純方法，并建立了建蘭花葉病毒RT-PCR快速檢測體系。

1材料

1．1毒源

毒源采自廈門蘭花圃，經(jīng)分離鑒定為CyMV。以蔓陀羅(DaturastFqlHOTIIUum)為繁殖寄主，摩擦接種CyMV，置隔離檢疫溫室內(nèi)培育生長，5～7d后開始發(fā)病，采集病葉保存在-40℃冰箱內(nèi)備用。

1．2試劑

Taq酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin均購自Pro—mega公司；Trizol試劑購自廣州華粵公司。

1．3引物

據(jù)已報(bào)道CYMV核酸序列進(jìn)行同源性比較。設(shè)計(jì)一對引物．上游引物PL<48～169)為5-CCCGAAGAAATCAAGGCCATA3；下游引物P2(898～919)為5—AGCACGTTCACGGTCAGTAGG3．設(shè)計(jì)目的片段為750bp，上海生物工程公司合成。

2方法

2．1病毒提純

參照Frowd等方法進(jìn)行改動，具體步驟如／min下：將100g冰凍病葉加入0.5 mol／L。檸檬酸鈉緩沖液100mI-在搗碎機(jī)中將病葉搗碎，過濾，用CCL，100ML乳化20 min，將濾液10 000 r／min離心20rain，上清液加入4％體積質(zhì)量的PEG(MW6 000)和o．25％體積質(zhì)量的NaCl攪拌溶解。4℃過夜；10000 r／min離心20min，沉淀用0．1 mol／L。硼酸鈉緩沖液懸浮，充分勻漿后攪拌1 h，5 000 r／min離心20rllln，取上清，4()000 r／mln離心2 h，沉淀用o．1 mol／I硼酸緩沖液上清液勻漿懸浮，5 000r／thin離心15min，上清液即為粗提純病毒制劑。將L：清液(粗提純的病毒)在超速離心機(jī)上以25 000 r／Illln離心2，5 h，取出病毒帶，在40 000r／mm離心2 h，沉淀用o．01 mol／I-硼酸鈉緩沖液懸浮，得提純CyMV。

2．2電鏡觀察

提純的病毒用2％磷鎢酸負(fù)染5 rflln．透射電鏡觀察。

2．3RNA提取

方法一：取200uL提純的病毒制劑，加800uLTrizol，200。DEPC處理過的水，混勻，室溫靜置5 nun；加200 uL無RNA酶的氯仿，用力混勻，室溫靜置3rain；4℃，12 000r／mln離心15rmn；取上層液體，加入500。無RNA酶的異丙醇，混勻，室溫靜置10min；4℃12 000r／rnln離心15mtn；上清液，加入無菌的70％乙醇14 7 500r／mm，5mm，棄上清液，風(fēng)干后即為RNA。方法二：提取組織(葉片)總RNA：先將組織加入液氮研成粉末，其余方法同方法一。以接種緩沖液的蔓陀羅為對照，并設(shè)空白對照。

2．4反轉(zhuǎn)錄

提純病毒抽提的RNA用37ulDEPC處理過的水溶解。反轉(zhuǎn)錄體系為：RNA制劑37、dNTP1、RNasin 0．5。及反轉(zhuǎn)錄Bufferl070 1101llin，冰浴5 min，加入RNasin 0．5下游引物l+反轉(zhuǎn)錄酶0．5／JI+42‘C 1 h。

2．5PCR擴(kuò)增

取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2PI。作為模板，引物P1、P2各o．2反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 nun，94 C 40 h58℃復(fù)性35 h72℃延伸40x，循環(huán)次數(shù)為35次，72 C延伸12rain。反應(yīng)結(jié)束后，取10 ILL擴(kuò)增產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠上(含EBo．5√mL)進(jìn)行電泳。

2．6RT-PCR檢測靈敏度的測定與應(yīng)用

對建立的建蘭花葉花病毒RT-PCR檢測體系進(jìn)行靈敏度測定并應(yīng)用該體系對廈門地區(qū)種植的大花蕙蘭、蝴蝶蘭、卡特蘭和石斛蘭進(jìn)行測定。

3結(jié)果

3．1病毒提純

通過使用不同方法對建蘭花葉病毒進(jìn)行提純，發(fā)現(xiàn)多次使用差速離心，病毒斷裂厲害；PEG沉淀次數(shù)過多，病毒得率很低。經(jīng)改進(jìn)，利用差速離心技術(shù)結(jié)合一次聚乙二醇(PEG6000)沉淀，再經(jīng)一次蔗糖不連續(xù)密度梯度離心，提純的病毒完整性和純度均較好，得率約400mg／k80提純的病毒經(jīng)2％磷鎢酸負(fù)染電鏡透射，可以觀察到大量K約475nm，寬約12niil的線狀病毒，與已報(bào)道的一致，如圖l所示。

3．2 RT-PCR擴(kuò)增

對純建蘭花葉病毒RNA和病組織總RNA分別進(jìn)行RT—PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明兩者的擴(kuò)增產(chǎn)物在泳道中均只有一條特異性染色帶，大小約600 bP，與預(yù)汁的目的片斷大小一致。

3．3檢測靈敏度測定

將提純的建蘭花葉病毒RNA和感病蘭花叫‘片組織液進(jìn)行梯度稀釋，然后測定RT-PCR對其檢測靈敏度。結(jié)果表明可檢出提純的建蘭花葉病毒RNA最低含量為1．8 pz，病葉組織11 mg／mL。

4討論

近年來，隨著蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蘭花的國際國內(nèi)貿(mào)易和種質(zhì)交換活動十分頻繁，這是病毒病遠(yuǎn)距離傳播的主要原因，而傳統(tǒng)血清學(xué)檢測方法一方而診斷符合率不高，另一方面難以達(dá)到早期診斷目的。因此建立靈敏、快速病毒病害檢測方法對加強(qiáng)口岸檢疫，從而防治建蘭花葉病毒傳人、傳播意義重大。建蘭花葉病毒的外殼蛋白基因是一個(gè)保守基閱。根據(jù)它的保守性，設(shè)汁引物，建立該病毒的檢測技術(shù)，這無疑是早期準(zhǔn)確診斷蘭花是否感病的有力證據(jù)。本文建立的RTPCR快速檢測體系靈敏度為純病毒RNA 1．8 pz，病葉組織ll mg／mL，取樣量少。應(yīng)用本檢測體系對廈門地區(qū)種植的大花蕙蘭、蝴蝶蘭、卡特蘭和石斛蘭病株，以及本室培養(yǎng)的蝴蝶蘭組培苗進(jìn)行測定，均能檢測出cyMv，其癥狀主要表現(xiàn)為葉片褪綠條紋、褪綠斑塊、致密黑斑和壞死斑。