張　昊　張　爭　許景升　徐　進　張麗勍　潘哲超　田　茜　馮　潔

摘要本文對瓊膠平板稀釋純化法進行了改良，建立了一種新方法一平板稀釋畫線分離法，既保留了其簡單快速，操作方便，易于掌握的優(yōu)點，又解決了可靠性差的缺點，適用于一些不易直接挑取的體積較小，顏色較淡的真菌孢子，如鐮刀菌等，和傳統(tǒng)分離方法相比節(jié)約了大量時間，適合大量樣品的分離純化。

關(guān)鍵詞真菌；單孢子；分離

中圖分類號S 432.1

由鐮刀菌引起的赤霉病是世界潮濕、半潮濕地區(qū)麥類作物的一種重要病害，近年來在北美迅猛擴展，在歐洲和南美地區(qū)也呈蔓延趨勢。在我國小麥赤霉病在北方地區(qū)已經(jīng)上升為小麥的主要病害。鐮刀菌不僅侵染作物造成產(chǎn)量損失，而且侵染谷物籽粒后產(chǎn)生的真菌毒素對人畜健康造成嚴重威脅，因此，科研工作者對其十分重視。研究鐮刀菌群體遺傳結(jié)構(gòu)、性征和同宗或異宗配合等生理現(xiàn)象，都要求菌種由單個孢子分離繁殖而來。所以，建立一套簡便高效的單孢子分離技術(shù)，能夠節(jié)省大量的時間，有利于后續(xù)工作的進行。目前常用的分離方法主要有：瓊膠平板稀釋純化法、瓊膠平板表面單孢子挑取法、眉毛挑針法，固定昆蟲針挑取法，鉛筆柄挑孢針挑取法等，它們各有利弊。筆者在短時間內(nèi)進行大量鐮刀菌單孢子分離的過程中，通過試驗對瓊膠平板稀釋純化法進行了改良，建立了平板稀釋畫線分離法，提高了此方法的可靠性，這種方法的分離效率高，適合大批量樣品的單孢子分離。

1材料與方法

1.1樣品

病組織樣品為采自全國12個省份具有典型癥狀的小麥赤霉病病穗3545個。

1.2試劑與儀器

超凈工作臺、顯微鏡、Eppendorf Mix Mate渦旋振蕩器、Eppendorf移液器、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、載玻片、PCR管、無菌水、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉、醫(yī)用氯霉素。

1.3方法

1.3.1孢子出現(xiàn)幾率統(tǒng)計

用移液器將PCR管裝入100μL無菌水，剝?nèi)“l(fā)病小穗最外面穎殼在無菌水中輕輕蘸浸一下，渦旋混勻，吸取1μL于載玻片，15×10倍顯微鏡下鏡檢，并稀釋至孢子量約1個／μL。取稀釋后孢子懸浮液2.0μL于載玻片，顯微鏡下鏡檢計數(shù)，重復(fù)200次。

1.3.2制備適宜濃度孢子懸浮液

取小麥赤霉病的病穗穎殼在裝有無菌水的PCR管(可用1.5mL或2mL的微量離心管)中輕輕蘸浸一下。取1μL鏡檢，稀釋至孢子含量1個／μL。

1.3.3 PDA培養(yǎng)基平板的制備

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，醫(yī)用氯霉素40mg，121℃高壓滅菌20min。

在超凈工作臺內(nèi)將培養(yǎng)基倒入滅菌平板，待平板內(nèi)培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板底部用記號筆畫5條平行線(圖1)。

1.3.4畫線

在超凈工作臺內(nèi)，用10μL移液器吸取2μL配置好的孢子懸浮液，沿著平板底部的一條直線在培養(yǎng)基上均勻畫線，重復(fù)5次。注意，盡量不要用槍頭劃壞培養(yǎng)基。

1.3.5恒溫培養(yǎng)

將畫線的平板放入培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)30h，直到可以看見沿著直線長出微小的菌落，大多1條線1～2個或無菌落，極少出現(xiàn)3～5個菌落的現(xiàn)象。

1.3.6單菌落的轉(zhuǎn)移

選取1條線只長出1個的菌落或1條線上相隔較遠的2個菌落，距離較近的2個菌落和1條線上長出多個的菌落則舍棄，選取菌落部位的底部用記號筆做標記，在超凈工作臺內(nèi)，將標記處培養(yǎng)基切下，轉(zhuǎn)移至新的PDA平板中，28℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.7菌落形態(tài)鑒定

培養(yǎng)3d后，觀察PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，進行鑒定，去掉鑒定為非赤霉病菌的菌株。

2結(jié)果與分析

2.1孢子出現(xiàn)幾率統(tǒng)計

對200次顯微鏡計數(shù)結(jié)果進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，2μL孢子懸浮液中出現(xiàn)1個孢子的幾率為50％，無孢子出現(xiàn)的幾率為35％，出現(xiàn)2個孢子的幾率為12％，3～5個孢子的幾率為3％(圖2)。

2.2平板稀釋畫線分離菌株

從3545個小麥赤霉病穗中分離到4000株小麥赤霉病菌，總污染率1.96％，分離到非赤霉病菌32株，占0.8％，總的單孢子分離成功率為97.24％。

3討論

影響瓊膠稀釋平板法可靠性的主要因素為孢子懸浮液的濃度，濃度過高，多個孢子聚集在一起的幾率較大，不能確定一個菌落是從單個孢子繁殖而來；而濃度過低可能長不出菌落。預(yù)試驗確定了在孢子濃度為1個／μL時，每2μL孢子懸浮液中出現(xiàn)1個孢子的幾率達到50％，而無孢子的幾率為35％，這樣單菌落由單孢子繁殖而來的可靠性就達到85％，只需繼續(xù)改良試驗方法，最大限度地排除出現(xiàn)2～5個孢子的15％情況即可得到可靠的單孢子分離物。

目前單孢子分離技術(shù)中廣泛應(yīng)用的主要有兩種方法：瓊膠平板稀釋純化法、瓊膠平板表面單孢子挑取法。其中，直接挑取法雖然得到的單孢子可靠，但操作復(fù)雜，難度大，較為費時費力，不適合大量樣品的分離，而且此方法更適用于體型大、有色、多細胞的真菌孢子如銹菌孢子，而鐮刀菌的分生孢子無色透明，隔著平皿在顯微鏡下反差很小，用此方法分離難度很大。瓊膠平板稀釋純化法操作簡便快速，初學(xué)者也易于上手，但是由于這種方法實質(zhì)上是分離菌落，不能看到和確定一個菌落是從單個孢子繁殖而來，純化的可靠性較差。

作者所建立的平板稀釋畫線分離法，保留了瓊膠平板稀釋純化法的優(yōu)點，方法簡單，初學(xué)者不用培訓(xùn)均可熟練掌握，分離效率高，適合各種類型真菌孢子的分離，尤其適合大量樣品的單孢子分離。另外，通過單孢子出現(xiàn)幾率的統(tǒng)計試驗大大提高了平板畫線的科學(xué)性，直接得單孢子繁殖菌落的幾率達到85％，同時作者采用平板畫線的方法，將2／xL孢子懸浮液涂成一條直線，試驗證明如果含有2個孢子，也大多能夠分散開，形成單獨的2個菌落，將極少出現(xiàn)的一條線上2個或多個菌落重疊的情況舍棄，保證了得到單孢子菌落的可靠性。由于每2／xL孢子懸浮液中不含孢子的幾率也達35％，作者采取在每個平板畫5條線的方法增大孢子出現(xiàn)幾率，在實際應(yīng)用過程中，很少出現(xiàn)不長菌落的平板。

常規(guī)的赤霉病菌分離方法需要首先將病?；蛩胼S用乙醇或次氯酸鈉溶液進行表面消毒，放入PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，3d后取初分離物放入CLA培養(yǎng)基，日光燈和365nm近紫光燈12h光暗交替的組培架上誘導(dǎo)產(chǎn)孢，10d后產(chǎn)生大型分生孢子，或挑取初分離菌絲體至綠豆湯培養(yǎng)基中，26℃、120r／min振蕩培養(yǎng)3d誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子，之后進行單孢子分離。作者采用病穗穎殼直接在無菌水中蘸浸的方法得到孢子懸浮液，比傳統(tǒng)方法節(jié)約時間6～13d，大大提高了工作效率。但直接從病組織上獲取孢子，畫線平板可能會少數(shù)出現(xiàn)細菌污染，因此需注意對單孢子轉(zhuǎn)移純化時的無菌操作，注意舍棄污染的菌落，并且在轉(zhuǎn)移單孢子的PDA培養(yǎng)基中加入醫(yī)用氯霉素來抑制細菌生長(畫線平板不加抗生素，否則可能會影響孢子萌發(fā)率)，取得了很好的效果，筆者用此方法大量分離鐮刀菌，污染率小于2％。

本方法還需要嚴格控制培養(yǎng)時間，在菌落微小的時候及時觀察并轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基，否則菌落長大后，距離較近的兩個菌落難于區(qū)分，影響方法的可靠性，禾谷鐮刀菌在30h為宜，最長不能超過36h。

本方法步驟簡單、分工明確，適合實驗室多人合作，能夠顯著提高分離效率，筆者所在實驗室采用稀釋平板畫線法在短時間內(nèi)完成了采自全國各地3500余個小麥赤霉病病穗的單孢子分離，其高效性得到了很好的體現(xiàn)。