岑貞陸　黃思良

摘要作者將常規(guī)植物病原菌組織分離法改進(jìn)成一種適合于荔枝霜疫霉病菌分離的簡(jiǎn)便、高效的新方法。分離的荔枝果實(shí)經(jīng)過(guò)100μg／mL多菌靈及36μg／mL鏈霉素的混合藥液浸泡處理，在無(wú)菌保濕的條件下采用病果對(duì)健果進(jìn)行病害誘發(fā)后進(jìn)行病原菌的分離純化。該新方法分離荔枝霜疫霉病菌的成功幾率大于傳統(tǒng)組織分離法。

關(guān)鍵詞荔枝；霜疫霉病菌；分離

中圖分類號(hào)S 436.67

荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)是荔枝的主要病害之一，其分類學(xué)地位是一科一屬一種，較為特殊。為了對(duì)荔枝霜疫霉病菌進(jìn)行相關(guān)研究，通過(guò)分離而獲得純的荔枝霜疫霉病菌是必要的。常規(guī)的病原菌分離方法是《植病研究方法》介紹的用75％乙醇和0.1％升汞液表面消毒處理。實(shí)際工作中，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離的樣本往往不是新鮮樣品，特別是存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的荔枝病果組織中常常帶有其他雜菌，按常規(guī)方法進(jìn)行分離組織病原菌時(shí)，由于這些雜菌的生長(zhǎng)較荔枝霜疫霉病菌迅速，雜菌的菌絲常將荔枝霜疫霉病菌覆蓋，而細(xì)菌也會(huì)抑制荔枝霜疫霉病菌的生長(zhǎng)。另外，荔枝霜疫霉病菌在常規(guī)培養(yǎng)基如PDA上生長(zhǎng)較差，而特殊培養(yǎng)基的配制又相對(duì)麻煩。因此，采用常規(guī)分離真菌方法分離荔枝霜疫霉病菌分離純化效果差，往往不易成功。為此，作者試將常規(guī)的真菌分離方法改進(jìn)成一種更為簡(jiǎn)便快捷分離荔枝霜疫霉病菌的新方法。

1分離操作

先將加熱熔化了的純瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后用打孔器(直徑為3～4mm)將培養(yǎng)基打成圓碟備用。再準(zhǔn)備兩個(gè)無(wú)菌的容器，容器內(nèi)裝有用無(wú)菌水配成的含有100μg／mL多菌靈及36μg／mL鏈霉素的混合藥液。將新采集的荔枝病果(品種為黑葉)置于RH為90％的密閉干燥器3～5d后，再采集新鮮健康果實(shí)(品種為黑葉)，然后將病果、健果分別浸泡于上述混合藥液中10min后撈起，分開晾干，在無(wú)菌塑料盒中放置4～8個(gè)健果(緊靠在一起排成一字形)，在隊(duì)列一端緊靠健果再放置1個(gè)病果，室溫下使健果發(fā)病，當(dāng)健果發(fā)病后，將原先的病果移走，依此類推，移走3～5個(gè)病果后，用接種針挑取純瓊脂圓碟，將純瓊脂圓碟輕觸塑料盒中病組織上的病菌孢子囊梗(注意：純瓊脂圓碟不要點(diǎn)觸到荔枝果皮)，使病菌分生孢子囊粘在純瓊脂圓碟上，然后將純瓊脂圓碟置于玉米粉瓊膠培養(yǎng)基(玉米粉300g、瓊脂17g、水1000mL)平板中央，于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，待病菌形成菌落，鏡檢觀察其培養(yǎng)性狀及有無(wú)其他雜菌，確認(rèn)是荔枝霜疫霉病菌并進(jìn)行單孢子純化，經(jīng)柯氏法則確認(rèn)其致病性后，將病原菌保存?zhèn)溆谩?/p>

2分離結(jié)果

在采用新方法進(jìn)行分離的試驗(yàn)中，共挑刺107個(gè)純瓊脂圓碟，5d后觀察到有83個(gè)純瓊脂圓碟在玉米粉瓊膠培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出荔枝霜疫霉病菌菌落，其中有34個(gè)荔枝霜疫霉病菌菌落受到其他雜菌的污染，結(jié)果顯示，分離出純荔枝霜疫霉病菌培養(yǎng)物的頻率為45.79％；而采用傳統(tǒng)組織分離方法進(jìn)行分離的試驗(yàn)中，共對(duì)96個(gè)組織塊進(jìn)行分離，5d后觀察到長(zhǎng)出真菌或細(xì)菌菌落的組織塊共68個(gè)，對(duì)分離所得的真菌菌落進(jìn)行鏡檢，沒有觀察到荔枝霜疫霉病菌。

3小結(jié)

與常規(guī)組織分離方法相比，該新方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用，不需要配制特殊的培養(yǎng)基，并省去乙醇和升汞消毒處理。(2)荔枝果實(shí)先經(jīng)過(guò)藥液浸泡處理，絕大部分雜菌已被殺死或被抑制，分離成功幾率大。