申建茹　郭　巍

摘要：蘇云金芽孢桿菌Bt營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vips主要分為Vip1、Vip2和Vip3 3種。Vip1和Vip2構(gòu)成二元毒素，對(duì)葉甲科昆蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性。Vip3對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有廣譜殺蟲(chóng)活性，該蛋白廣泛存在于Bt中，與已知?dú)⑾x(chóng)晶體蛋白ICPs沒(méi)有序列相似性。Vip3通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡，這與Bt δ-內(nèi)毒素的作用機(jī)理完全不同，Vips的發(fā)現(xiàn)對(duì)于Bt的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。本文主要對(duì)營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vips的分布、特性、作用機(jī)制及應(yīng)用等進(jìn)行報(bào)道。

關(guān)鍵詞：營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白；二元毒素；Vip3A；蛋白特性；作用機(jī)制

中圖分類號(hào)：S 476．11

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在芽孢形成期產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidalcrystal proteins，ICPs)是殺蟲(chóng)的主要活性成分，ICPs通過(guò)作用于昆蟲(chóng)中腸而導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡[i-33。由于ICPs對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleopter-a)、雙翅目(Diptera)等多種重要的農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)均具毒殺作用，Bt已成為目前研究最深入、應(yīng)用最廣的殺蟲(chóng)微生物。但是，在實(shí)際應(yīng)用中仍有許多重要農(nóng)作物害蟲(chóng)對(duì)ICPs低敏感或不敏感，并且由于大規(guī)模和連續(xù)使用Bt，一些種群對(duì)Bt制劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。因此，尋找具有與ICPs不同殺蟲(chóng)作用方式的蛋白以延緩抗性產(chǎn)生具有深遠(yuǎn)的意義。

Estrueh和Warren等人于1996年和1998年分別從B。thuringiensis菌株AB88和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)菌株AB78上清液中發(fā)現(xiàn)了新型分泌殺蟲(chóng)蛋白，即營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(vegetative insecti-cidal proteins，Vips)，該類蛋白從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期開(kāi)始分泌，直到穩(wěn)定前期達(dá)到最高峰，具有熱不穩(wěn)定性，95℃處理20 min便失活；一般不形成伴孢晶體且與已知的ICPs沒(méi)有序列相似性，最重要的是其殺蟲(chóng)作用機(jī)理與ICPs不同。該蛋白的發(fā)現(xiàn)使Bt在殺蟲(chóng)活性、殺蟲(chóng)范圍方面得到很大突破，在一定程度上克服了多種害蟲(chóng)對(duì)ICPs低敏感或不敏感的弊端?？梢?jiàn)，Vips是一個(gè)極為豐富而且具有巨大潛力的資源，該領(lǐng)域已成為Bt研究的熱點(diǎn)。

Vips主要分為Vipl、Vip2和Vip3 3種。最近，Bt蛋白命名委員會(huì)提出按照Bt Cry毒蛋白的分類命名方法，將所有的Vip蛋白和類Vip毒素蛋白分為3個(gè)種、8個(gè)亞種以及更下一級(jí)的分類。

1Vip1／Vip2

對(duì)于vip1A／vip2A的研究較少，目前GenBank已收錄的全長(zhǎng)vip1A／vip2A基因主要有4種。

1.1vip1A／2A基因的分布及Vip1A／Vip2A的殺蟲(chóng)活性

Warren等人認(rèn)為vip1A／vip2A基因在芽孢桿菌中分布較廣，約為11.9％。作者對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的171株野生型Bt菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到20株含有vip1A／vip2A基因的菌株，檢出率為11.69％(申建茹，郭巍，待發(fā)表)，與Warren等人的研究結(jié)果一致，而師永霞等人得出的檢出率僅為2％。

vip2A基因正位于vip1A基因的上游，兩基因的ORF(open reading frame)之間僅相差4個(gè)堿基。對(duì)viplA(a)／vip2A(a)基因的亞克隆和移碼突變分析表明，兩者的表達(dá)產(chǎn)物構(gòu)成二元毒素，對(duì)玉米幼芽根葉甲等葉甲科昆蟲(chóng)具有特異性，但對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)無(wú)效。

1.2Vip1A／Vip2A蛋白的特性及其作用機(jī)理

Blast結(jié)果表明，ViplA蛋白N-端氨基酸序列相似性明顯高于C-端，Vip2A蛋白的C-端氨基酸序列相似性明顯高于N-端。而且Vip2A蛋白的保守性較高。

Vip1A(a)分子量為100 ku，分泌到胞外時(shí)，N-端1～33位氨基酸信號(hào)肽被切除，加工成約為80 ku的蛋白質(zhì)。ViplA(a)與炭疽桿菌(Bacillus anthra-cis)的主要毒素成分即保護(hù)性抗原(protective antigen，PA)具有氨基酸序列相似性，PA可以將有活性的酶分子轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞中。Vip2A(a)的信號(hào)肽位于其N-端1～49位氨基酸，其N-端還存在LKID-KVEDF(53～66)，因此在成熟蛋白質(zhì)中信號(hào)肽已被切除。Vip2A(a)蛋白與一些具有ADP核糖轉(zhuǎn)移酶活性的二元毒素的酶活成分具有序列相似性，因此Vip2蛋白也代表了一種肌動(dòng)蛋白-ADP核糖基化毒素的家族。Vip2蛋白的酶結(jié)構(gòu)區(qū)域是一種混合的a／β蛋白，分為兩個(gè)domain，即N-domain(60～265氨基酸)和C-domain(266～461氨基酸)，C-domain能夠與NAD結(jié)合，突出的N-domain與Vip1蛋白相互作用。

對(duì)于典型的A-B型二元毒素，兩個(gè)功能不同的亞基或結(jié)構(gòu)域必須組裝成復(fù)合物才能發(fā)揮活性。但Vip1和Vip2的作用方式不同，二元毒素的兩種多肽并不結(jié)合，而是獨(dú)立行使功能。100 ku的Vip1多聚體具有膜結(jié)合能力，為Vip2進(jìn)入靶標(biāo)昆蟲(chóng)細(xì)胞質(zhì)提供途徑；含有NAD結(jié)合位點(diǎn)的Vip2具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可能在Arg177處阻止肌動(dòng)蛋白的多聚化，引起肌動(dòng)蛋白無(wú)法構(gòu)成細(xì)胞骨架，由于肌動(dòng)蛋白微絲亞基的快速交接從而導(dǎo)致昆蟲(chóng)最后死亡。

2Vip3

2.1Vip3A的殺蟲(chóng)活性

Vip3A對(duì)草地貪夜蛾(Spodoptera frugiper-da)、甜菜夜蛾(S.exigua)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)等對(duì)ICPs不敏感或低敏感的昆蟲(chóng)具有廣泛的殺蟲(chóng)活性，且毒效都在納克(ng)水平上，對(duì)小地老虎(Agrotis ipsilon)的毒性比Cry1Ac高260倍，但對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)無(wú)效。Vip3A類蛋白間的序列相似性在98.6％～100％之間，已有文獻(xiàn)報(bào)道該類蛋白僅第206、284、291、406、464、742位氨基酸的變動(dòng)頻率偏高，隨著研究的深入，目前已經(jīng)鑒定的Vip3A蛋白共28個(gè)，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Vip3A蛋白在第284、358、406、536、633、755、761、776位氨基酸的變動(dòng)頻率均較高。但僅幾個(gè)氨基酸的差異，蛋白間的殺蟲(chóng)譜和毒性卻差異很大。Vip83蛋白N端比Vip-C9蛋白多兩個(gè)氨基酸，對(duì)小菜蛾表現(xiàn)高活性，而Vip-C9對(duì)小菜蛾的活性很低。

2.2vip3A基因的分布和保守性分析

vip3A基因廣泛存在于Bt菌株中，分布率為15％～63％。劉金環(huán)等從606株Bt菌株中鑒定出382株含有vip3A基因，分布率高達(dá)63％，其中315株含有與mip3Aal相同的基因帶型。

作者從本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的171株野生型Bt菌株中篩選出63株含vip3A基因的菌株，vip3A分布率為36.84％，63株均含有與vip3Aal相同的基因帶型(申建茹、郭巍，待發(fā)表)，這與前人的研究結(jié)果一致，充分說(shuō)明該類基因在遺傳上比較保守，可能是Bt菌株某種結(jié)構(gòu)或功能所必需的關(guān)鍵基因。

2.3vip3A基因的鑒定及其定位研究

GenBank收錄的vip基因大多屬于vip3A型基因。截至2008年4月9日，GenBank已收錄的vip3A全長(zhǎng)基因共有28個(gè)，具體見(jiàn)表1。1996年Estruch等研究發(fā)現(xiàn)，vip3A(a)基因位于染色體DNA上，但是此后定位研究表明vip3A基因是定位于質(zhì)粒上，因此該類基因的定位是因菌株而異還是全部定位于某特定質(zhì)粒上，仍有待研究。

2.4Vip3A(a)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

Vip3A(a)的分子量為88 ku，N-端含有帶正電荷氨基酸(Asn2～Lys7)及其相連的疏水核心功能區(qū)(Leu8～Met34)，這與其他芽孢桿菌的信號(hào)肽序列類似。但是Vip3A(a)蛋白N-端缺少信號(hào)肽酶作用位點(diǎn)，因此，易位時(shí)不進(jìn)行N-端加工，這種情況在G⁺細(xì)菌中較少見(jiàn)。功能結(jié)構(gòu)域分析表明，其N-端存在一個(gè)引導(dǎo)序列，不被切除卻起著分泌到細(xì)胞外的作用，C-端存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)相似肽。初步說(shuō)明了Vip3A是一種與信息傳遞相關(guān)的蛋白，在分泌到細(xì)胞外后可能要發(fā)揮某種功能，而C-端結(jié)合結(jié)構(gòu)域則可能正是發(fā)揮蛋白功能的區(qū)域。

Estruch等研究表明，C-端150個(gè)氨基酸區(qū)域決定Vip3A(a)殺蟲(chóng)譜，Selvapandiyan等證明缺失C-端220個(gè)氨基酸的Vip3A-S對(duì)斑禾草螟和斜紋夜蛾都失去了殺蟲(chóng)活性，證明Vip3A蛋白C-端含有穩(wěn)定功能區(qū)，對(duì)于維持Vip3活性至關(guān)重要，缺失或增加幾個(gè)氨基酸都會(huì)使它的活性完全喪失，因此不同Vip3蛋白C-端的變異可能是對(duì)不同生物活性的選擇。陳建武等構(gòu)建缺失N-端27個(gè)氨基酸的Vip-S184缺失體失去了對(duì)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性，揭示了Vip3A信號(hào)肽序列對(duì)該類基因的殺蟲(chóng)活性是十分重要的，而且在大腸桿菌中對(duì)于蛋白可溶性、包涵體形成位置和殺蟲(chóng)活性等是必需的，在Bt中影響蛋白的表達(dá)時(shí)相、分泌性和殺蟲(chóng)活性。劉榮梅等通過(guò)構(gòu)建缺失蛋白Vip-C9-N，也表明N-端信號(hào)肽序列(39個(gè)氨基酸)對(duì)甜菜夜蛾的活性是必需的。

2.5Vip3A的作用機(jī)理

Vip3A(a)與敏感昆蟲(chóng)的中腸液進(jìn)行混合處理后，可形成4條主要蛋白帶：22 ku、33 ku、45 ku和66 ku。非敏感昆蟲(chóng)的中腸液也可以將Vip3A蛋白水解成上述4種蛋白帶，但是并不會(huì)導(dǎo)致明顯的病理變化。Vip3A蛋白僅結(jié)合在敏感昆蟲(chóng)的中腸細(xì)胞上，因而Vip3A(a)的殺蟲(chóng)作用譜和其與中腸上皮細(xì)胞結(jié)合與否直接相關(guān)。

細(xì)胞病理學(xué)試驗(yàn)表明：飼喂小地老虎和草地貪夜蛾等敏感昆蟲(chóng)Vip3A(a)蛋白72 h后，中腸上皮杯狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞與基膜完全脫落，昆蟲(chóng)死亡。Vip3A引起的癥狀與ICPs的相似，但是時(shí)間上推遲了。Vip3A蛋白只要在pH低于7.5時(shí)即可溶解，其C-端也不被切除，與敏感昆蟲(chóng)上皮結(jié)合，誘發(fā)昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡(PCD)，細(xì)胞核溶解，最終昆蟲(chóng)死亡。Lee等根據(jù)煙草天蛾BBMV的配體印跡發(fā)現(xiàn)，Vip3A與CrylAb毒蛋白在煙草天蛾中腸上的受體明顯不同，為一類80 ku或100 ku左右的蛋白，而激活的CrylAb毒蛋白的受體是120 ku的氨肽酶(APN)類似物和250 ku的鈣黏蛋白(cadherin)類似物。蛋白雜交試驗(yàn)證明，Vip3A并不是結(jié)合到已知的Cry1Ac的受體上，并且Vip3A與Cry1Ac和Cry2Ab2之間存在著對(duì)BBMV的非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。

3Vips的應(yīng)用前景

蘇云金芽孢桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)分泌的蛋白質(zhì)對(duì)于殺蟲(chóng)活性來(lái)說(shuō)是一個(gè)極豐富的資源，表現(xiàn)出較為廣闊的應(yīng)用前景。

3.1構(gòu)建工程菌

通過(guò)Vips之間、Vips和ICPs之間以及Vips和其他與殺蟲(chóng)有關(guān)的蛋白之間融合構(gòu)建嵌合蛋白，將為有效地構(gòu)建特異高毒力工程菌提供新的途徑。將Vip1和Vip2的受體結(jié)合功能區(qū)或易位功能區(qū)與其他殺蟲(chóng)蛋白融合，可以增大融合蛋白的殺蟲(chóng)范圍或增強(qiáng)其殺蟲(chóng)活性。Vip3A和ICPs之間可能存在著協(xié)同增效作用；將不同生物活性的vip基因通過(guò)基因序列交換或者改造，可以獲得殺蟲(chóng)譜更廣、活性更高的融合基因；將vips基因單獨(dú)在高毒力Bt菌株中進(jìn)行表達(dá)或?qū)⒃摶蚺cICPs基因進(jìn)行共表達(dá)，構(gòu)建的工程菌株對(duì)于擴(kuò)大殺蟲(chóng)譜、提高殺蟲(chóng)活性和延緩抗性等方面均具有重要意義。

3.2構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物

對(duì)vip3基因的研究利用也可以作為轉(zhuǎn)基因植物抗性管理策略之一。Vip3新菌株、新殺蟲(chóng)特性、新殺蟲(chóng)蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)和報(bào)道層出不窮，為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物提供了新的殺蟲(chóng)基因資源，vip3A(a)基因可以全序列或以毒性片斷導(dǎo)入植物?，F(xiàn)在Vips已經(jīng)成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因殺蟲(chóng)植物的構(gòu)建，先正達(dá)公司已成功地將Vip3A導(dǎo)入不同作物，得到高效抗蟲(chóng)多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米、棉花，延緩了抗性發(fā)展。2004年，先正達(dá)公司將轉(zhuǎn)包括該基因的多價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花在美國(guó)進(jìn)行田間釋放試驗(yàn)，大大提高了植物的抗蟲(chóng)性，降低了防治費(fèi)用，減少了環(huán)境污染，降低了損失，顯示了很好的應(yīng)用前景。

3.3殺蟲(chóng)活性物質(zhì)的篩選

Vip1、Vip2、Vip3 3種殺蟲(chóng)蛋白具有特殊的殺蟲(chóng)作用機(jī)理，可以為篩選新的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)提供新的思路，可用于篩選誘發(fā)細(xì)胞凋亡或者是跨膜前后產(chǎn)生活性的化學(xué)配體，包括生物小分子、多肽或蛋白質(zhì)。

3.4其他方面

可以將vip基因?qū)肫渌挎邨U菌或酵母、其他殺蟲(chóng)微生物或者根際微生物，有利于原有性狀的改良。此外，對(duì)VIPs的研究對(duì)于研制廣譜殺蟲(chóng)劑具有重要的意義，也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。