鐘　濤　尹　姣　劉　懷　王進(jìn)軍　李克斌　韋永貴　曹雅忠

摘要利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了編碼草地螟(Loxostege stzcticalis)觸角中一種普通氣味結(jié)合蛋白的基因。序列分析表明，成熟蛋白的序列中含有閱讀框序列，推導(dǎo)的氨基酸序列與已報(bào)道的11種鱗翅目昆蟲普通氣味結(jié)合蛋白I比較，平均相似度在62.3％左右，并擁有氣味結(jié)合蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征。該基因歸屬于普通氣味結(jié)合蛋白I基因亞族。因此將它命名為LstiGOBPl。

關(guān)鍵詞草地螟；觸角；普通氣味結(jié)合蛋白；RT-PCR；RACE

中圖分類號Q 785，S 433.4

草地螟[Loxostege sticticalis(Linnaeus)]又名網(wǎng)錐額野螟、甜菜網(wǎng)螟，屬鱗翅目、螟蛾科、野螟亞科、錐額野螟屬，是我國東北、華北和西北地區(qū)發(fā)生的多食性害蟲之一，取食為害大豆、苜蓿和甜菜等作物，具有遠(yuǎn)距離遷飛為害和周期性暴發(fā)特性，嚴(yán)重威脅了我國北方的農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。

草地螟對寄主植物具有明顯的選擇取食、產(chǎn)卵為害的特性，其中，嗅覺識別又是蛾類感知寄主植物信息的重要方式。靈敏的嗅覺在草地螟搜尋合適的寄主植物及選擇產(chǎn)卵地的過程中發(fā)揮著重要作用，而觸角作為昆蟲最主要的嗅覺感受器官，能夠依靠化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行信息的傳遞，從而在數(shù)萬種化合物分子中識別出它所需要的氣味分子。已有研究證實(shí)，在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目等全變態(tài)昆蟲中都發(fā)現(xiàn)了氣味結(jié)合蛋白(OBPs)的存在，這種蛋白能結(jié)合疏水性氣味化合物，并攜帶它們快捷地穿過水溶性的淋巴液，實(shí)現(xiàn)氣味在觸角表皮與嗅覺神經(jīng)元上的膜結(jié)合受體之間傳遞。

目前，對草地螟與寄主植物之間的化學(xué)通訊研究比較缺乏，僅在草地螟對寄主植物的選擇性及寄主植物的揮發(fā)物質(zhì)行為反應(yīng)等方面進(jìn)行了研究。因此，開展草地螟感知、識別寄主的分子機(jī)理方面的研究不僅能夠揭示其選擇寄主植物的分子機(jī)制，而且還可以為進(jìn)一步了解草地螟與寄主植物之間的化學(xué)信息聯(lián)系，闡明草地螟選擇寄主產(chǎn)卵與取食的內(nèi)因提供可靠的理論依據(jù)，同時(shí)為研制、開發(fā)防控草地螟的藥劑提供新思路。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1供試?yán)ハx

草地螟幼蟲用野生灰菜飼養(yǎng)，成蟲羽化后3 d內(nèi)分別剪下雌、雄觸角，立即放在液氮中速凍，然后-70℃保存。

1．1．2菌種及質(zhì)粒

pGEM-T Easy載體購自Promega公司，感受態(tài)大腸桿菌DH5a購自北京博大泰克公司。

1．1．3主要試劑及工具酶

Ex Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、3'-Full RACE CoreSet購自TaKaRa公司，Ampicillin、X-gal、IPTG購自北京博大泰克公司，總RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒等購自QIAGEN公司，質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒及DNA Marker(DL4000和D50)購自北京明日百傲公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1．2方法

1．2．1觸角總RNA的提取及cDNA第1鏈合成

將保存的草地螟雌、雄成蟲觸角各取20 mg，加液氮搗碎組織后，使用QIAGEN公司的RNeasyMini Kit提取總RNA，經(jīng)NanoDrop核酸濃度儀測定含量后，使用cDNA第1鏈合成試劑盒合成CD—NA第1鏈。

1．2．2引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已登錄的其他蛾類昆蟲的GOBPl基因序列[家蠶(Bombyx mori)、黃地老虎(Agrotis segetum)、小地老虎(A.ipsilon)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、煙芽夜蛾(Heliothis vi—rescens)、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、中國柞蠶(Antheraea pernyi)、煙草天蛾(Manduca sexta)、煙實(shí)夜蛾(Helicoverpa assulta)的GenBank登錄號分別為NM_001044031、DQ838577、DQ838578、AY049739、 X96862、EFl59978，Y10970、M73797、AY864774]設(shè)計(jì)并合成引物：正向引物(gps4)：5-GTBATGAARGAYGTCACBCTNGG-3；反向引物(gpa4)：5-AGGTTRAAGTGBCKGCTCAT-3(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

1．2．3PCR擴(kuò)增

以合成的cDNA第1鏈為模板，反應(yīng)體系為cD-NA 2μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP2taL(各2.5 mmol/L)，TaKaRa Ex Taq(5U/μL)0.25μL，正反引物各1μL(10 μmoL/L)，加滅菌水至25μL，混勻、離心，然后放入PCR儀(Eppendorf Mastercycler Gra—dient)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃變性3 min；接著35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為94℃45 s，56.6℃45 s，72℃1 min，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增完畢后，用2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化，并回收目的片段。

1．2．4PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定

利用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將純化得到的DNA連接到pGEM—T Easy載體，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，然后涂布在含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)16 h。待長出藍(lán)、白斑后，隨機(jī)挑取白斑，培養(yǎng)后采用質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒提取質(zhì)粒，利用菌落PCR和EcoR工酶切的方法，鑒定重組克隆PGEM/LstiGOBPl。

1．2．5序列測定和分析

DNA的序列測定在北京奧萊博生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行。

1．2．6RACE擴(kuò)增

以RT-PCR得到的目的DNA序列，按照試劑盒的要求設(shè)計(jì)引物，并參照說明書擴(kuò)增該基因的cDNA的3末端序列。目的DNA片段的上游特異性引物(3R-g01)：5-GACGGAGGAGTTCTTC—CACTTCTG-3(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；試劑盒中的下游接頭引物(3sites Adap—tor Primer)：5-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3。

1．2．7RACE產(chǎn)物的克隆和鑒定

方法參照1．2．4 PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定。

1．2．8序列測定和分析

DNA的序列測定在北京奧萊博生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2．1GOBP1基因的擴(kuò)增和克隆

以草地螟觸角cDNA為模板擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物，分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析

。從中可以明顯看出，PCR及3RACE擴(kuò)增的產(chǎn)物長度分別達(dá)到170 bp和500 bp左右，并且它們分別經(jīng)EcoR I酶切后得到的條帶與設(shè)計(jì)相符。

2．2序列測定和分析

草地螟CK)BPl基因的核苷酸序列，推導(dǎo)的氨基酸序列位于核苷酸序列之下，方框內(nèi)為保守的半胱氨酸位點(diǎn)。該基因已在GenBank中登錄，登錄號為EU413989。

序列測定和結(jié)果分析表明，已獲得草地螟(X)BPl基因開放閱讀框?yàn)?23 bp，編碼142個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測的分子量為16.1ku，等電點(diǎn)為5.00。該蛋白擁有氣味結(jié)合蛋白的共同特征，序列中含有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，呈酸性，且雌雄蟲GOBPl的核苷酸序列相同。

利用DNASIS軟件，根據(jù)Robson的方法對編碼GOBPl-Lsti的mRNA進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明該基因的二級結(jié)構(gòu)主要為a一螺旋。此外，采用Kyte和Doolittle等的方法對GOBPl-Lsti氨基酸序列進(jìn)行親脂性分析，表明該蛋白中包含3個(gè)親脂性區(qū)域。這些區(qū)域很可能是親脂性氣味物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。

利用NCBI BLAST network server在Gen—Bank/EMBL中進(jìn)同源性搜索發(fā)現(xiàn)，在GenBank/EMBL中登錄的有完整序列的昆蟲GOBPl基因共11種?；谛蛄械耐葱员容^發(fā)現(xiàn)(表1)，昆蟲GOBPl氨基酸序列具有明顯的同源性，平均相似度在62.3％左右。

通常物種間的親緣越近，GOBPl的核苷酸和氨基酸序列的同源性也會越高。從LstiGOBPl與其他11種已知蛾類的進(jìn)化樹可以看出，草地螟與它們在進(jìn)化水平上相隔很遠(yuǎn)。因此，相對其他11種蛾類來說，草地螟與它們的親緣較遠(yuǎn)。

3討論

本試驗(yàn)利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)從草地螟觸角RNA中克隆了編碼草地螟GOBPl的基因，根據(jù)測序結(jié)果推導(dǎo)的氨基酸序列具有氣味結(jié)合蛋白的典型特征，屬于GOBPl蛋白亞族，并依據(jù)慣例將它命名為LstiGOBP1。

鱗翅目昆蟲觸角中的普通氣味結(jié)合蛋白(GOB—Ps)的基因序列高度同源，氨基酸和核苷酸序列都非常保守。在LstiGOBPl蛋白序列中包含7個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，其中6個(gè)半胱氨酸的空間分布在不同的物種間始終恒定(圖6)。半胱氨酸普遍遵循著這樣一個(gè)規(guī)則，X₁₈-Cys-X₃₀-Cys-X₃-Cys-X₄₂-Cys-X_8-10-Cys-X₈-Cys-X_24-26，其中X代表任意氨基酸。而這6個(gè)保守的半胱氨酸在LstiGOBPl的空間分布恰好符合X₁₅-Cys-X₃₀-Cys-X₃-Cys-X₄₂-Cys-X₁₀-Cys-X₈-Cys-X₂₇，很顯然，LstiGOBP1的N末端還不十分完整。

在對草地螟普通氣味結(jié)合蛋白家族的兩個(gè)成員(GOBPl和GOBP2)的分析中(另文發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)GOBPl基因并沒有GOBP2基因那樣在分科水平上高度保守，而是呈現(xiàn)出離散的特點(diǎn)，例如97—100、117—122氨基酸之間具有明顯的差異，這可能反映了LstiGOBPl在進(jìn)化中的變異與功能的分化。Krieger提出氣味結(jié)合蛋白的種類在昆蟲觸角中是極其龐大的觀點(diǎn)，而Vogt也認(rèn)為OBPs的種類和變異恰好反映了昆蟲間化感行為的多樣性。

可以通過二硫鍵的聯(lián)結(jié)信息來了解翻譯后的蛋白修飾情況。經(jīng)SCRATCH預(yù)測LstiGOBPl的蛋白序列，二硫鍵的發(fā)生位點(diǎn)分別在Cysl6-Cys51、Cys105-Cys119和Cys94-Cys114。而Leal在對家蠶信息素結(jié)合蛋白基因的二硫鍵結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，該蛋白中存在3個(gè)二硫鍵，分別位于Cys19-Cys54、Cys50-Cys108和Cys97-Cys117?？紤]到LstiGOBP1蛋白序列還不完整，所以與Leal的研究結(jié)果是一致的。但僅僅在第2個(gè)二硫鍵的構(gòu)成上有所不同，在LstiGOBP1蛋白序列中，由第5(Cys105)與第7(Cys119)共同形成了二硫鍵。這種差異很可能決定了GOBP1結(jié)合氣味因子的形狀和種類。此外，在多數(shù)已研究的蛾類中，都存在著第7個(gè)半胱氨酸，而且它的位點(diǎn)也是十分保守的(圖6)。

GOBPs的三維結(jié)構(gòu)目前還不十分清楚，但是其疏水和親水結(jié)構(gòu)域在載體蛋白中的特性分布非常重要，Krieger預(yù)測的疏水結(jié)構(gòu)域通常在第40～60個(gè)氨基酸之間，這可能是用來結(jié)合氣味化合物的區(qū)域。Steinbrecht的研究小組證實(shí)GOBPs在觸角中是專一表達(dá)的，分布在含有特殊識別功能的受體細(xì)胞的感覺器中，它們只對食物和寄主氣味有特殊反應(yīng)，但不包括信息素分子。Feng也證實(shí)GOBPl具有更廣泛地結(jié)合綠色植物和有花植物的氣味分子的功能。LstiGOBP1同樣包含了交替變化的疏水和親水結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)決定了其結(jié)合氣味分子并運(yùn)送的功能。

通常GOBP1成熟蛋白包含144～146個(gè)氨基酸，而氨基酸數(shù)目的恒定也維持GOBP1蛋白的功能穩(wěn)定。N末端親水性區(qū)域通常有18～26個(gè)氨基酸，該肽段揭示了信號肽的性能特征信息。目前，在LstiGOBP1序列中還未包含完整的N末端信息，5RACE試驗(yàn)正在開展之中。