楊隨莊　葉春雷　曹世勤

摘要：以永良4號(hào)春小麥幼胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，將獲得的愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)后獲得45株移栽成活的再生植株，通過田問條銹病誘發(fā)鑒定選擇，獲得了抗條銹病小麥種質(zhì)資源材料4-8。研究結(jié)果表明，4-8在田間連續(xù)5個(gè)世代中均表現(xiàn)對(duì)當(dāng)前流行的條銹菌混合菌系(條中31號(hào)、條中32號(hào)、水-4、水-5、水-7、水-14)免疫；人工接種鑒定中，在苗期對(duì)上述混合菌系表現(xiàn)免疫，成株期分小種和混合菌系鑒定中仍表現(xiàn)免疫，說明通過組織培養(yǎng)獲得的小麥種質(zhì)材料4-8具有穩(wěn)定遺傳的條銹病抗性變異，從而為利用體細(xì)胞無性系變異進(jìn)行小麥抗條銹病新種質(zhì)創(chuàng)制提供了可能。

關(guān)鍵詞：小麥條銹??；小麥體細(xì)胞無性系；抗條銹病新種質(zhì)

中圖分類號(hào)：S 435．121

小麥條銹病是由條銹菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici)引起的一種世界性重要病害，在我國也：黽發(fā)生范圍最廣、危害最重的小麥病害之一，是限制小麥生產(chǎn)的重要生物因素之一，曾多次大流行并造成巨大損失?；瘜W(xué)防治雖能降低條銹病的危害，但從資源節(jié)約、環(huán)境友好、綠色發(fā)展的：角度來看，選育和推廣種植抗病品種才是最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的控制途徑。因此，抗銹育種是一項(xiàng)長期而重要的工作。選育新品種的根本在于種質(zhì)資源的發(fā)掘、創(chuàng)造、研究和利用，已通過常規(guī)育種、染色體工程、外源DNA導(dǎo)入等方法獲得了小麥抗銹種質(zhì)資源和品種，為促進(jìn)小麥生產(chǎn)作出了重要貢獻(xiàn)。本文通過組織培養(yǎng)方法獲得了抗條銹病小麥種質(zhì)資源，為利用體細(xì)胞無性系變異進(jìn)行小麥抗條銹病育種提供參考。目前未見類似報(bào)道。

1材料與方法

1．1組織培養(yǎng)獲得無性系植株

將永良4號(hào)小麥?zhǔn)诜?自花授粉)后14 d的幼胚接種在MS+2，4-D 2 mg／L+KT 0.5 mg／L+AgNO₃8 mg／L+CH 300 mg／L+蔗糖3％+瓊脂粉0.5％培養(yǎng)基上，在25℃條件下暗培養(yǎng)30 d獲得愈傷組織，挑選新鮮的愈傷組織接種在MS+2，4-D 1～2 mg／L+KT 0.5 mg／L+CH 300 mg／L+ABA 0.5 mg／L+蔗糖6％+谷氨酰胺0.5 g／L+瓊脂粉0.5％繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每25～30天繼代培養(yǎng)1次，培養(yǎng)6個(gè)月后(培養(yǎng)溫度為25℃，自然散射光照)，將繼代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(MS+KT 1.0 mg／L+IAA 0.5 mg／L+CH 300 mg／L+蔗糖3％)上，在25℃、2 000～3 000 1x、16 h(光)∥8 h(暗)條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)獲得再生植株(R₁代植株)，練苗后移栽到溫室中，同時(shí)種植供體親本永良4號(hào)為對(duì)照，常規(guī)管理，抽穗后套袋自交，成熟后按單株收獲種子。

1．2無性系株系抗條銹病田間誘發(fā)鑒定

田間試驗(yàn)于2002－2006年在甘肅農(nóng)科院蘭州試驗(yàn)農(nóng)場進(jìn)行。按行長1.80 m、行距0.20 m、株距0.04 m點(diǎn)播種植(南北方向)，每行點(diǎn)播46粒，R₂代材料種子全部播種，R₃代及其以后各世代材料播種2行，每10份無性系材料設(shè)一原供體親本永良4號(hào)為對(duì)照(種2行)。在試驗(yàn)小區(qū)的垂直方向(東西方向)兩邊種植銘賢169作為誘發(fā)行，每年4月底～5月初用心葉涂抹法在銘賢169上接種當(dāng)前流行混合條銹菌系，于6月20日左右觀察記載條銹病發(fā)病情況。對(duì)獲得的抗銹新品系再送本院植保所進(jìn)行專門鑒定。田問觀察記載和考種項(xiàng)目按常規(guī)育種要求進(jìn)行，系譜法選擇，各種材料按種植小區(qū)和株系收獲。

1．3無性系品系抗條銹病人工接種鑒定

抗條銹病人工接種鑒定試驗(yàn)于2006年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所蘭州溫室和甘谷試驗(yàn)站進(jìn)行。種植及接種方法進(jìn)行，每處理重復(fù)3次。

1．4條銹病記載標(biāo)準(zhǔn)

條銹病的記載采用全國統(tǒng)一的0、0；1、2、3、4六級(jí)記載標(biāo)準(zhǔn)，0～2表示抗病，3～4表示感病。

1．5供試條銹菌種

誘發(fā)鑒定中將條中31號(hào)、條中32號(hào)、水-4、水-5、水-7、水-14菌系等量混合后接種銘賢169；將上述菌系等量混合，在苗期人工接種供試材料；在成株期，分別將各菌系和等量混合菌系接種供試材料。所有菌系均由本院植保所提供。

2結(jié)果與分析

2．1組織培養(yǎng)及再生植株表現(xiàn)

2000年接種永良4號(hào)幼胚500個(gè)，獲得愈傷組織491塊，愈傷組織誘導(dǎo)率為98.2％，繼代培養(yǎng)后進(jìn)行再分化培養(yǎng)獲得再生植株55株，植株再生率為11.2％。55株再生植株移栽到溫室中，成活45株。這些再生當(dāng)代植株(R₁代)總體表現(xiàn)為：株高顯著降低，約為對(duì)照的30％～70％，葉片變窄變短，株型小而緊湊，穗長變小，小穗數(shù)減少，抽穗期和成熟期顯著提前或推遲，有的R₁植株移栽成活30 d后即抽穗，有的植株比對(duì)照晚熟20 d以上。所表現(xiàn)的這些變異除包含有可遺傳變異外，也有組織培養(yǎng)的生理效應(yīng)。

2．2無性系株系抗條銹病誘發(fā)鑒定

2002年將45個(gè)再生株系(R₂)全部種植在田間，其中代號(hào)為4-8、4-21、4-27的株系中出現(xiàn)抗病植株和感病植株兩種類型，4-8株系中出現(xiàn)了19株一致的抗條銹病變異類型(反應(yīng)型為0型)，而另外2個(gè)株系中出現(xiàn)了分離的抗病變異類型(4-21株系中出現(xiàn)3株抗銹單株，4-27株系中出現(xiàn)4株抗銹單株，各單株的條銹病反應(yīng)型為1～2型，原供體親本永良4號(hào)的反應(yīng)型為4型)。將R₂代中抗病的32個(gè)單株全部收獲，考種，在R₃代中種植為32個(gè)株系，這32個(gè)株系間條銹病抗性發(fā)生分離，其中19個(gè)株系表現(xiàn)一致抗條銹病(反應(yīng)型為0型，對(duì)照品種永良4號(hào)為4型)，占觀察株系數(shù)的59.4％，1個(gè)株系抗病性表現(xiàn)分離(其中出現(xiàn)3個(gè)抗病單株，反應(yīng)型為2型，其余為3～4型)，占觀察株系數(shù)的3.1％，其余12個(gè)株系表現(xiàn)不抗條銹病(反應(yīng)型為4型)，占觀察株系數(shù)的37.5％。說明R₂代中出現(xiàn)的大部分抗條銹病性狀能夠遺傳到R₃代，37.5％的株系在R₂代中出現(xiàn)的抗病變異性狀不能傳遞到R₃代，或者是由于突變獲復(fù)而表現(xiàn)為親本的抗性水平。

根據(jù)R₃代抗銹材料的田問農(nóng)藝性狀表現(xiàn)和考種結(jié)果，從中入選253個(gè)單株種植成R₄株系進(jìn)行鑒定觀察，其中來源于R₃代中19個(gè)株系表現(xiàn)一致抗銹的250個(gè)單株株系間抗病性一致(反應(yīng)型為0型，對(duì)照品種永良4號(hào)為3型)，說明這些株系的抗病變異性狀已穩(wěn)定，并能傳遞，而另外3個(gè)株系表現(xiàn)為不

抗條銹病(反應(yīng)型為3～4)，說明這些抗病變異性狀不能遺傳或發(fā)生了突變獲復(fù)。根據(jù)田間觀察和考種評(píng)價(jià)，這些材料的農(nóng)藝性狀基本穩(wěn)定，株系內(nèi)整齊一致，各株系間在株高、株形、穗長、抗銹性方面相似，在有效分蘗、穗粒數(shù)、德粒重方面差異明顯，與原供體親本之間差異明顯。從R₄代中入選45個(gè)抗條銹病株系(均來源于R₂代的4-8株系)進(jìn)入R₅代進(jìn)行抗銹性鑒定和農(nóng)藝性狀觀察，在R₅和R₆代中，這45個(gè)株系的抗銹性和農(nóng)藝性狀在株系內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定一致，株系間及與原供體親本對(duì)照問差異明顯，并保持了R₄代中的特性，說明抗銹性及其他農(nóng)藝性狀變異在R₃代已穩(wěn)定，并能遺傳到以后的3個(gè)世代。

根據(jù)無性系材料歷代田間表現(xiàn)和考種分析結(jié)果，從中決選一個(gè)株系，定名為4-8，其生物學(xué)特性見表1(R₆代結(jié)果)。與原供體親本永良4號(hào)相比較，4-8對(duì)條銹病免疫，落黃熟相好，葉片變小，上舉，葉功能期延長，株高降低，生育期提前，有效分蘗和結(jié)實(shí)小穗數(shù)增加，穗長、穗粒數(shù)和千粒重變小。

2．3無性系株系抗條銹病人工接種鑒定

2006年將4-8及其原供體親本永良4號(hào)一并送本院植保所進(jìn)行條銹病抗性人工接種鑒定，鑒定結(jié)果表明(表2)，4-8在苗期和成株期對(duì)目前流行小種混合菌免疫，成株期對(duì)各生理小種也表現(xiàn)免疫，這一結(jié)果和田間誘發(fā)鑒定的結(jié)果相同，進(jìn)一步說明了獲得的抗條銹病變異性狀遺傳到R₆代中，4-8具有良好的條銹病抗性。

3討論

體細(xì)胞無性系變異是植物組織培養(yǎng)過程中的一種普遍現(xiàn)象，已從組織培養(yǎng)再生植株的形態(tài)、生理生化、分子水平上得到驗(yàn)證。有關(guān)體細(xì)胞無性系抗病性的變異已在小麥、大麥、水稻、珍珠粟、亞麻等作物中得到證實(shí)。用體細(xì)胞無性系變異方法進(jìn)行作物抗病性改良一般有兩種方法，一是在組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入病原物(或病原物毒素)作為篩選劑進(jìn)行脅迫選擇而獲得抗病突變體，二是利用組織培養(yǎng)過程中的自然變異，通過抗病性鑒定而獲得抗病無性系種質(zhì)。本項(xiàng)研究中的4-8小麥品系就是通過后一種方法獲得再生植株，在田間誘發(fā)鑒定中選擇得到的無性系后代材料，通過連續(xù)5個(gè)世代田間誘發(fā)鑒定選擇及人工接種鑒定，對(duì)當(dāng)前流行的條中31號(hào)、條中32號(hào)、水-4、水-5、水-7、水-14條銹病菌系表現(xiàn)免疫，證明其抗銹性能穩(wěn)定遺傳，這是利用體細(xì)胞無性系變異的前提條件。說明了利用體細(xì)胞無性系變異創(chuàng)造抗條銹小麥種質(zhì)資源的可行性，而且該方法簡便、時(shí)間短，同時(shí)也可進(jìn)行其他農(nóng)藝性狀改良。目前未見有關(guān)小麥體細(xì)胞無性系抗條銹病的報(bào)道。

由于植物體細(xì)胞無性系變異的隨機(jī)性，既有正向變異，又有負(fù)向變異，而且往往有幾個(gè)性狀同時(shí)發(fā)生變異，在一個(gè)無性系材料中同時(shí)出現(xiàn)目標(biāo)性狀的變異頻率低，因此，從育種的觀點(diǎn)出發(fā)，為了達(dá)到目標(biāo)性狀綜合改良的目的，就要保證足夠多的再生植株，這樣才有可能得到理想的突變體。目前，就小麥組織培養(yǎng)再生體系來說，總的情況是組織培養(yǎng)植株再生率比較低，因此研究和優(yōu)化小麥組織培養(yǎng)再生體系，提高組織培養(yǎng)植株再生率是小麥體細(xì)胞無性系變異育種的一項(xiàng)重要工作。本研究中只獲得了45個(gè)再生植株，從中決選出1個(gè)品系，雖然該品系在株高、生育期、株型、抗銹性、有效分蘗方面優(yōu)于原供體親本，但穗長、穗粒數(shù)和千粒重方面出現(xiàn)了不利變異，其生產(chǎn)利用價(jià)值有待進(jìn)一步鑒定。

體細(xì)胞無性系中，上一代中表現(xiàn)出的變異在下一代不表現(xiàn)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因一方面是由組織培養(yǎng)的生理效應(yīng)引起，另一方面與突變的恢復(fù)有關(guān)。在其他作物體細(xì)胞無性系變異中也有類似的報(bào)道。本研究中，R₂代中獲得32個(gè)抗銹單株，最終只有19個(gè)單株的抗銹變異性狀遺傳到R₆代，這種現(xiàn)象在研究其他農(nóng)藝性狀時(shí)也出現(xiàn)，是體細(xì)胞無性系變異中的一個(gè)普遍現(xiàn)象。

變異性狀穩(wěn)定速度快是體細(xì)胞無性系變異的…·個(gè)特點(diǎn)。本文研究中，4-8的抗條銹病變異在R₃代中已穩(wěn)定，并能傳遞到以后的3個(gè)世代，進(jìn)一步證實(shí)了前人的研究結(jié)果。

有關(guān)4-8品系的抗銹性遺傳學(xué)研究目前著手開始組配雜交組合(正反交)，擬對(duì)其抗條銹性遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行研究。