馬艷玲　吳鳳芝　劉守偉

摘要：選取不同抗性黃瓜品種中農(nóng)13(抗)和中農(nóng)6號(感)為試材，采用蘸根法接種，利用電鏡技術(shù)和石蠟切片方法觀察了病菌侵染前后根莖組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，抗病品種有環(huán)紋和網(wǎng)紋兩種導(dǎo)管類型，有較厚的角質(zhì)層，感病品種有環(huán)紋導(dǎo)管一種類型，無角質(zhì)層。抗病品種在接種后細(xì)胞壁加厚、導(dǎo)管腔內(nèi)出現(xiàn)褐色物、胞壁覆蓋物以及侵填體。感病品種僅出現(xiàn)胞壁加厚和胼胝體。對于病原菌侵染，抗感品種具有不同程度的反應(yīng)，抗病品種反應(yīng)程度早于且強(qiáng)于感病品種。

關(guān)鍵詞：黃瓜；枯萎病菌；組織病理學(xué)

中圖分類號：S 432．23

枯萎病屬于維管束病害，是影響黃瓜生長的主要土傳病害之一。常年發(fā)病率10％～30％，重病年份可達(dá)80％～90％，其病原菌為半知菌亞門鐮孢屬的尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cu-cumerinum Owen)，我國流行的菌系為生理小種4號，引起這類病害的鐮孢屬真菌是土壤習(xí)居菌，病菌孢子的芽管或菌絲體由根毛侵入或通過根部傷口侵染植物。由一個孢子的一次侵染就足以引入病原物到植物內(nèi)部。寄主植物的抗病性分為組織結(jié)構(gòu)抗性和生理生化抗性兩個方面，組織結(jié)構(gòu)抗病性是利用組織和結(jié)構(gòu)的特點阻止病原物的接觸、侵入和擴(kuò)展。本試驗對不同抗性黃瓜品種接種枯萎病菌，目的是探討寄主植物在組織結(jié)構(gòu)方面的抗性機(jī)制。

1材料與方法

1．1供試材料

供試黃瓜品種為中農(nóng)13(抗病)和中農(nóng)6號(感病)，種子由哈爾濱市農(nóng)科所提供。

1．2供試菌種

尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusarium oxysporumf.sp．cucumerinum)分離于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗實習(xí)基地溫室內(nèi)的黃瓜枯萎病病株。病原菌的分離、純化、培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備參照王拱辰等、方中達(dá)的方法。

1．3試驗方法

供試品種種子經(jīng)表面消毒后，播于滅菌的沙箱中，出苗后按日本山崎配方施營養(yǎng)液。成分為Ca(NO₃)₂·4H₂O826 mg／L，KNO₃607 mg／L，NH₄H₂PO₄115 mg／L，MgSO₄·7H₂O483 mg／L，微量元素為：NaFe-EDTA 20～40 mg／L，H₃BO₃2.86 mg／L，MnSO₄·7H₂O 2.13 mg／L，ZnSO₄·7H₂O0.22 mg／L，CuSO₄·5H₂O 0.08 mg／L，(NH₄)₆Mo₇P₂₄·4H₂Omg／L。待幼苗長至3～4片真葉時清水洗凈根部沙粒，再用蒸餾水沖洗2次后，在1×10⁷個／mL的孢子懸浮液中浸根30 min，浸沒深度1 cm左右。之后取出放入上述營養(yǎng)液中水培。定期切取根莖部觀察。

將切取的1mm大小的材料放入4%戊二醛中進(jìn)行前固定，pH7.2磷酸緩沖溶液沖洗，1％鋨酸后固定，梯度乙醇一丙醇脫水，Epon-812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，雙重染色后，在透射電鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化以及病原真菌的侵染狀況。

石蠟切片制樣采用蕃紅固綠雙重染色法，參照李桂琴的方法。

2結(jié)果與分析

2．1枯萎病菌對抗病黃瓜品種的侵染過程及病理組織學(xué)變化

圖1是抗病品種枯萎病菌侵染過程及病理組織學(xué)變化，結(jié)果顯示：接種后16 h，抗病品種根莖部的角質(zhì)層表面附著大量有隔或無隔的分生孢子(圖1a)，由于角質(zhì)層較厚，開始萌發(fā)的孢子長出的菌絲體因難以有充足的營養(yǎng)提供而部分死亡。而入侵到表皮細(xì)胞的菌絲體在細(xì)胞間隙內(nèi)生長，附近細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離(圖1b)，薄壁細(xì)胞有細(xì)胞壁加厚現(xiàn)象(圖1c)，細(xì)胞內(nèi)容物豐富(圖1d)，線粒體清晰(圖1e)。接種后40 h，發(fā)現(xiàn)通過皮層薄壁細(xì)胞的菌絲產(chǎn)生的孢子(圖1f)，以及薄壁細(xì)胞連接處的孢子(圖1g)，同時觀察到細(xì)胞壁增厚及斷裂現(xiàn)象(圖1h)。第64 h，在導(dǎo)管附近出現(xiàn)少量菌絲及其孢子(圖li)，而同時導(dǎo)管腔出現(xiàn)大量褐色物(圖1j)，并且發(fā)現(xiàn)有的導(dǎo)管壁分泌一層覆蓋物(圖lk)，而周圍并無菌絲。88 h后，導(dǎo)管內(nèi)產(chǎn)生一個侵填體(圖1e)。

2．2枯萎病菌對感病黃瓜品種的侵染過程及病理組織學(xué)變化

圖2是感病品種枯萎病菌侵染過程及病理組織學(xué)變化，結(jié)果顯示：在接種后16 h，根莖部表皮細(xì)胞由于無角質(zhì)層的覆蓋而被萌發(fā)的孢子降解(圖2a)。內(nèi)皮層薄壁細(xì)胞內(nèi)線粒體、高爾基體等細(xì)胞器發(fā)育良好，清晰可見(圖2b、c)。接種后40 h，皮層薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁溶解，內(nèi)有大量孢子(圖2d)，線粒體外膜部分?jǐn)嗔?，脊模糊不?圖2e、f)，細(xì)胞間隙有大量菌絲，同時胞壁變厚(圖2g)。第64 h(圖2h、i)，細(xì)胞變形，內(nèi)容物溶解(圖2h)，在胞壁斷裂處有小孢子出現(xiàn)(圖2i)。第88 h，篩管內(nèi)的菌絲在向前生長時遇到胼胝體(圖2j)。

2．3抗感枯萎病黃瓜品種根莖導(dǎo)管類型的差異

圖3是抗感黃瓜品種根莖導(dǎo)管類型差異，結(jié)果顯示：抗病品種的導(dǎo)管類型有兩種，即環(huán)紋導(dǎo)管和網(wǎng)紋導(dǎo)管(圖3a、b)；感病品種僅有環(huán)紋導(dǎo)管一種類型(圖3c、d)。

3討論

史金瑞、苗琛等在西瓜枯萎病的細(xì)胞學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，抗病品種比感病品種具有較厚的角質(zhì)層，本試驗結(jié)果與此相類似。程玉瑾等在研究西瓜枯萎病時沒有發(fā)現(xiàn)抗感品種西瓜根部存在結(jié)構(gòu)差異。徐建華等對黃瓜枯萎病的研究中發(fā)現(xiàn)抗病品種較感病品種的壁覆蓋物厚、抗病品種中侵填體有細(xì)胞核，感病品種中侵填體發(fā)育不充分。Mace等認(rèn)為壁覆蓋物、侵填體、褐色物等這些保衛(wèi)反應(yīng)的產(chǎn)生限制了菌絲擴(kuò)展，對菌絲的入侵具有一定的阻礙作用。陳珉等認(rèn)為感病品種的螺紋導(dǎo)管較多，而抗病品種以網(wǎng)紋導(dǎo)管為豐。本試驗結(jié)果表明，選取的兩個黃瓜品種存在結(jié)構(gòu)上的差異，抗病品種有角質(zhì)層，有環(huán)紋和網(wǎng)紋兩種導(dǎo)管類型；感病品種無角質(zhì)層，有環(huán)紋導(dǎo)管一種類型?？共∑贩N受到病菌侵染后，較早的產(chǎn)生細(xì)胞壁增厚，褐色物，侵填體等，感病品種僅產(chǎn)生胞壁加厚和胼胝體。由于本試驗僅選取2個品種，試驗結(jié)果的普遍性有待于對更多的材料進(jìn)行研究才能確認(rèn)。