閆　磊　肖　婷　牛洪濤　于天叢　羅萬春

摘要：利用離體生測方法，系統(tǒng)測定和比較了15種植物源化合物對馬鈴薯莖線蟲的活性。結果表明，dl-薄荷醇和香茅醇等10種化合物對馬鈴薯莖線蟲具有較高的活性；選用6種高活性化合物對馬鈴薯莖線蟲的毒力測定結果表明：處理24 h和48 h后6種化合物的LC₅₀由小到大的順序分別為：油酸＜間苯三酚＜間苯二酚＜檸檬酸＜dl-薄荷醇＜香茅醇；油酸＜間苯二酚＜香茅醇＜間苯三酚＜檸檬酸＜dl-薄荷醇。

關鍵詞：植物源化合物；馬鈴薯莖線蟲；活性

中圖分類號：S 482．51

馬鈴薯莖線蟲(Ditylenchus destructorThorne，1945)，是農(nóng)作物重要病原線蟲，主要為害馬鈴薯塊莖和甘薯塊根，我國過去一直將其列為對外檢疫對象。除了馬鈴薯和甘薯外，它還能為害豌豆、花生等，但在我國主要為害甘薯，可引發(fā)甘薯莖線蟲病。甘薯是山東、河北、河南等北方地區(qū)的重要作物。當前甘薯生產(chǎn)亟待解決的突出問題是防治分布廣泛的甘薯莖線蟲病，又俗稱糠心病，受害甘薯一般減產(chǎn)20 ％～30％，嚴重的達70％～80％，甚至絕收，是甘薯上的一種毀滅性病害。

如今，甘薯莖線蟲病的防治主要依賴化學防治，目前廣泛使用的藥劑主要有辛硫磷、克百威、苯線磷、甲基異柳磷、滅線磷、涕滅威等。而涕滅威憑借其防治成本低，防效及增產(chǎn)效果好的特點，被廣泛推廣使用。但這些應用防治的藥劑以高毒和劇毒產(chǎn)品為主，對人畜極不安全，并且對環(huán)境造成了很大污染。而植物源殺線蟲劑來源于自然界，在環(huán)境中易降解，對人類安全，具有良好的環(huán)境相容性，已越來越受到人們的重視。目前已報道的具有殺線蟲活性的植物源化合物約有10多類100余種，表明在環(huán)境友好殺線蟲劑的研究與開發(fā)中該類化合物具有很大潛力。本文系統(tǒng)測定和比較了文獻已報道的具有殺線蟲活性的15種植物源化合物對馬鈴薯莖線蟲的活性，以加深對此類化合物的認識并為其選擇性開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1供試化合物

15種供試植物源化合物見表1。

1．2供試線蟲的分離培養(yǎng)

供試線蟲為馬鈴薯莖線蟲(Ditylenchus de-structor)，將采集到的病薯(甘薯)用自來水沖洗干凈，剖開病薯，用刀切成薄片，然后用鑷子將病薯撕成小塊，在漏斗底部鋪上兩層餐巾紙，將切好的病薯小塊放人漏斗中加入無菌水，下面用帶止水夾的橡膠管相連，每隔12 h左右打開止水夾用燒杯接取橡膠管中下部的液體備用。

將分離到的線蟲用無菌水洗出，沖入無菌的指形管中，用0.5％的次氯酸鈉消毒2 min，然后用無菌水沖洗2～3遍，使線蟲自然沉降或用離心機使線蟲快速沉淀(6 000 r／min，3 min)。再在離心管中加入各約500 mg／kg的鏈霉素(100萬單位／g)，保持1 h，離心后吸出消毒液。再用無菌水沖洗3遍，定容到一定體積放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在PDA(約20 mL)平板中接入灰葡萄孢(Botrytis ci-nerea Pers)，25℃溫箱中暗培養(yǎng)。待菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，在培養(yǎng)基中央刻一小口，加入消毒過的馬鈴薯莖線蟲約500條。將培養(yǎng)皿用封口膜(Para-film)包好，正置放入25℃溫箱中黑暗培養(yǎng)。接種培養(yǎng)2～3 d后將培養(yǎng)皿皿蓋朝下放置，繼續(xù)培養(yǎng)35～40 d，將培養(yǎng)皿皿蓋上的線蟲用無菌水沖洗到燒杯中備用。

1．3室內(nèi)毒殺活性測定(藥液浸泡法)

參照萬樹青使用的浸漬法進行。將15種化合物用丙酮(溶于水的則用無菌水)配制成一定濃度的母液備用。將同樣體積(V₁)的線蟲懸浮液注入24孔細胞培養(yǎng)板的樣品孔內(nèi)，再根據(jù)試驗濃度[按式(1)計算]需要補充添加的無菌水(V₂)，最后加入相應量的藥劑母液(V₃)，混合均勻后置于27℃培養(yǎng)箱中。每處理4次重復，每重復50～100條線蟲。處理后24 h與48 h分別檢查各處理的線蟲死亡／存活情況，按式(2)和式(3)分別計算線蟲死亡率和校正死亡率。

式中：V=線蟲懸浮液體積V₁+補充無菌水體積V₃+藥劑母液體積V₃，試驗中N是事先設定的；為保證處理線蟲數(shù)量的一致性，V₁也是固定的，如V₁=100 μL；No是已知的，那么將V固定，一般V=400 μL。據(jù)此可以得出不同處理的V₂、V₃。

2結果與分析

2．1供試化合物對馬鈴薯莖線蟲的室內(nèi)(離體)活性測定結果

按1．3藥液浸泡法對馬鈴薯莖線蟲進行室內(nèi)生物活性測定(試驗濃度為2 mg／mL)。試驗中設空白對照(根據(jù)預試驗，當丙酮與甲醇濃度低于20％時，對馬鈴薯莖線蟲無顯著影響)。測定結果見表2。

由表2結果可以看出：藥劑處理后24 h，dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸、間苯二酚、間苯三酚、槐胺堿、野靛堿、槐定堿和槐果堿這10種化合物對馬鈴薯莖線蟲表現(xiàn)出強烈的毒殺活性，線蟲的校正死亡率均達89％以上，其結果與其他各處理問存在顯著性差異，其中dl-薄荷醇的校正死亡率最高，達99.78％；另外，具有中等殺線蟲活性的處理為苦豆堿和苦參堿。

藥劑處理后48 h，各處理的防治效果有了一定的變化，dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸、間苯二酚、間苯三酚、槐胺堿和野靛堿這8種化合物仍對馬鈴薯莖線蟲表現(xiàn)出強烈的毒殺活性，線蟲的校正死亡率均達89％以上，其結果與其他各處理間存在顯著性差異，其中DL-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸的校正死亡率最高，均達到了100.00％；而苦豆堿和槐定堿則表現(xiàn)出中等殺線蟲活性。

通過圖1比較15種化合物處理后24 h與48 h的校正死亡率，可以發(fā)現(xiàn)槐定堿、槐胺堿、槐果堿48 h的校正死亡率反而低于其24 h的結果；其原因可能是此3種化合物在處理后24 h對馬鈴薯莖線蟲表現(xiàn)出一定的擊倒作用，但線蟲并沒有被真正殺死，只是暫時被擊倒麻痹，經(jīng)過一段時間后又出現(xiàn)復蘇現(xiàn)象。

2．2供試化合物對馬鈴薯莖線蟲的毒力比較

為了進一步對供試化合物進行活性篩選和比較，根據(jù)表2的結果選定了dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸、間苯二酚、間苯三酚進行系統(tǒng)毒力測定。根據(jù)預試驗，將供試化合物配制為5個濃度，則6種化合物對馬鈴薯莖線蟲的毒力結果如表3所示。

由表3的結果不難看出，處理24 h后6種化合物的LC₅₀由小到大的順序為：香茅醇＜dl-薄荷醇＜檸檬酸＜間苯二酚＜間苯三酚＜油酸；處理48 h后6種化合物的LC₅₀由小到大的順序為：dl-薄荷醇＜檸檬酸＜間苯三酚＜香茅醇＜間苯二酚＜油酸。

3討論

本文測定的4類15種植物源化合物多數(shù)已經(jīng)被報道具有殺線蟲活性，其中香茅醇和dl-薄荷醇對根結線蟲具有較好的活性，且從本試驗結果看，它們對馬鈴薯莖線蟲也表現(xiàn)出較高的毒殺活性。對本試驗中采用的鄰苯二酚、對苯二酚及間苯三酚，文獻僅報道可以抑制腎形小盤旋線蟲(Rotylenchulusreniformis)對番茄的侵染，而苦豆堿、苦參堿、槐胺堿及野靛堿可以殺死松材線蟲，本試驗結果豐富了前人的研究內(nèi)容，證明了上述化合物同樣對馬鈴薯莖線蟲具有一定的毒殺活性。另外，有報道用毒扁豆堿1 000 μg／mL可以可逆性地抑制起絨草莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)的運動，但本試驗結果表明其對馬鈴薯莖線蟲基本無效。有機酸類化合物檸檬酸和油酸對馬鈴薯莖線蟲也具有較好的活性，這個結果提示，在殺線蟲劑選擇性開發(fā)中是應該予以考慮的。

對本試驗中所得到的6種化合物的毒力方程進一步分析，可以看出毒力較好的香茅醇和dl-薄荷醇的6值有一定的差異，其中b值較低的dl-薄荷醇相比香茅醇而言可能就具有較高的抗藥性風險，而明確這一點對于該類化合物的更進一步認識具有深層次的意義。

植物源殺線蟲劑來源于自然界，具有很好的環(huán)境相容性，因而是環(huán)境友好殺線蟲劑研究開發(fā)的重要途徑；自然界具有豐富的植物資源，應該深入開展殺線蟲植物資源的調(diào)查，有效地從備選植物中分離、提純殺線蟲化合物并鑒定其化學結構；同時，對已經(jīng)報道的高活性植物源殺線蟲化合物進行活性一結構相關性研究，明確其作用機理，開展仿生合成，應成為開發(fā)高效、環(huán)保型的殺線蟲劑的重要思路。