李文鳳　黃應(yīng)昆　盧文潔　羅志明

摘要：研究了甘蔗花葉病抗病性鑒定的一種新技術(shù)甘蔗生長期切莖接種法。此法和傳統(tǒng)苗期手指摩擦接種法相比，接種后發(fā)病率極顯著地高于手指摩擦接種法，且發(fā)病均勻、結(jié)果穩(wěn)定，可以有效地區(qū)分不同甘蔗品種(材料)之間對(duì)病害的抗感性。比較11個(gè)甘蔗品種材料生長期切莖接種法和田間自然感病法對(duì)srMV-HH1的抗性鑒定，結(jié)果表明：兩種方法發(fā)病率呈正相關(guān)，且相關(guān)程度極密切，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 7，鑒定所得的抗病性和抗病等級(jí)結(jié)果完全一致，說明切莖接種法鑒定結(jié)果能真實(shí)反映甘蔗品種材料的自然抗感性；此外該方法簡便實(shí)用、可操作性強(qiáng)、接種工效高，因此可以對(duì)大批量材料進(jìn)行鑒定和篩選。

關(guān)鍵詞甘蔗花葉病；接種新技術(shù)；生長期切莖接種法

中圖分類號(hào)：S 435．661

甘蔗花葉病是一種重要的世界性甘蔗病害。近年來，該病在我國福建、廣東、廣西、四川和浙江等蔗區(qū)普遍發(fā)生，目前已成為云南蔗區(qū)發(fā)生最為普遍，危害最為嚴(yán)重的主要病害。全省年發(fā)病面積達(dá)6.67萬hm²以上，其中嚴(yán)重發(fā)病面積達(dá)3.3萬hm²以上，且有逐年擴(kuò)展蔓延加重危害之趨勢。感病品種，發(fā)病嚴(yán)重田塊發(fā)病率高達(dá)100％。甘蔗感病后一般造成10％～40％的產(chǎn)量損失，糖分下降。其病原復(fù)雜，可由馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、高粱花葉病毒(Sbrghum mosaic virus，SrMV)、玉米矮花葉病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、約翰遜草花葉病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、玉米花葉病毒(Zea mosaic virus，ZeMV)、甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)等6種病毒單獨(dú)或復(fù)合侵染引起。此病主要靠蚜蟲、帶病蔗種和蔗刀等收砍工具傳播。國內(nèi)外大量的研究表明：對(duì)甘蔗花葉病最經(jīng)濟(jì)有效的控制方法，就是選用抗病優(yōu)良品種。因此對(duì)甘蔗種質(zhì)資源進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)、篩選優(yōu)良抗源以指導(dǎo)培育抗病品種成為育種學(xué)家和植病學(xué)家共同的重要目標(biāo)。優(yōu)良抗源的篩選工作必須以數(shù)量多、范圍廣的甘蔗種質(zhì)資源抗性評(píng)價(jià)為基礎(chǔ)，因此急需研究建立一套快速簡便、致病性穩(wěn)定、規(guī)范、實(shí)用的抗性鑒定技術(shù)。

目前甘蔗種質(zhì)資源對(duì)花葉病的抗性鑒定方法有大田病圃鑒定、田間自然感病鑒定和人工接種鑒定。它們各具有優(yōu)點(diǎn)和局限，大田病圃鑒定和田間自然感病鑒定是最為普遍、直觀的方法。但其鑒定周期長、占用土地面積大、鑒定材料數(shù)量有限；而且由于病圃和田間中的自然病原及種類分布不均勻、氣候和傳播媒介等環(huán)境條件變化常常會(huì)影響鑒定結(jié)果的真實(shí)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。人工接種鑒定快速簡便、鑒定材料數(shù)量不受限制，且環(huán)境條件可人為控制，可以滿足大規(guī)模篩選抗源材料的需要。目前常用的人工接種方法有噴霧接種法、手指摩擦接種法。噴霧接種法主要用于大批量材料接種，手指摩擦接種法則用于小批量材料接種。但兩種方法都需要在接種時(shí)用手工搓揉蔗葉制造傷口，由于不易掌握搓揉力度，往往導(dǎo)致搓揉傷口不均勻，從而使接種后發(fā)病不均勻，致病性不穩(wěn)定，影響鑒定結(jié)果。此外，由于甘蔗葉片表面布滿毛群，葉緣鋸齒尖利，人工摩擦(搓揉)易劃傷手，也給具體操作帶來困難，導(dǎo)致接種工效低。鑒于此，本研究在現(xiàn)有的、普遍采用的苗期接種技術(shù)基礎(chǔ)上，研究建立了甘蔗生長期切莖接種鑒定法，并與苗期手指摩擦接種鑒定法和田問自然感病鑒定法結(jié)果進(jìn)行比較。

1材料與方法

1．1供試甘蔗品種材料

供試甘蔗品種從本所脫毒健康苗圃選擇粵糖79-177、臺(tái)糖134、川糖61-408、粵糖89-240、云蔗89-151、桂11、Co281、cp31-588、拔地拉、ROC10、ROC22等品種無病健壯蔗株，各品種蔗株分別切成雙芽苗，在流動(dòng)冷水中浸泡48 h之后，用(50±0.5)℃熱水處理2～3 h，再用80％敵敵畏和50％多菌靈可濕性粉劑1：800液浸種5～10 min，然后分別種植在塑料桶內(nèi)，置于防蟲溫室，常規(guī)栽培管理。

1．2接種病毒源及接種液準(zhǔn)備

病毒源取自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所李文風(fēng)等從甘蔗上分離鑒定的高粱花葉病毒強(qiáng)致病性分離物SrMV～HH1(另文發(fā)表)，繁殖保存在甘蔗品種云蔗89-151上。

接種前取幼嫩的病葉組織剪細(xì)后，加3倍量(V／W)濃度為0.1 mol／L，pH為7.2的磷酸緩沖液(含0.2％Na₂SO₄)，研磨成勻漿，雙層紗布過濾，濾液即為病毒接種液。

1．3鑒定方法

1．3．1手指摩擦接種法

選擇甘蔗苗期陰涼的傍晚進(jìn)行接種。撒適量500～600目金剛砂于病毒接種液中，攪拌混勻，以拇指和食指尖沾濕接種液，緊捏供試甘蔗小苗基部，加壓輕輕搓揉至擦傷蔗葉表皮，重復(fù)接種3次，每次間隔7 d，每個(gè)品種接種20株。

發(fā)病率調(diào)查方法：首次接種7 d后，開始調(diào)查發(fā)病率，以后每隔15天調(diào)查1次，直至發(fā)病率穩(wěn)定為止。調(diào)查記錄接種日期、接種苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病叢數(shù)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[6]的標(biāo)準(zhǔn)按1～5級(jí)分級(jí)進(jìn)行抗性水平分類(表1)。

1．3．2切莖接種法

甘蔗生長期進(jìn)行。用鋒利刀片或枝剪把甘蔗植株地上部分沿土表快速切去，再用滴管吸1滴病毒接種液滴入留下的地下蔗頭創(chuàng)面上，每品種接種20株，之后用報(bào)紙蓋住遮光24 h后揭開。

發(fā)病率調(diào)查方法：接種20 d后，開始調(diào)查發(fā)病率，以后每隔15天調(diào)查1次，直至發(fā)病率穩(wěn)定為止。調(diào)查記錄接種日期、出苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病叢數(shù)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：同1．3．1。

1．3．3田間自然感病法

選擇本所甘蔗花葉病易于發(fā)生和傳播的田塊設(shè)置自然感病試驗(yàn)觀察田。上述11個(gè)供試品種，每品種種植2行，行長5 m，為1小區(qū)。小區(qū)間種植1行病蔗(云蔗89-151)，作為病原，各小區(qū)隨機(jī)排列，重復(fù)3次。

發(fā)病率調(diào)查方法：種植50 d后，開始調(diào)查發(fā)病率，以后每隔30天調(diào)查1次，直至發(fā)病率穩(wěn)定為止。調(diào)查記錄種植日期、出苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病叢數(shù)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：同1．3．1。

2結(jié)果與分析

2．1兩種接種方法接種效果比較

通過比較兩種接種方法甘蔗花葉病的接種效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)：11個(gè)供試材料中，除Co281兩種接種方法都未致其發(fā)病外，其余10個(gè)材料甘蔗生長期切莖接種法發(fā)病率均比手指摩擦法高，且發(fā)病顯著、發(fā)病均勻。以其發(fā)病株率作百分?jǐn)?shù)顯著性t測驗(yàn)，p＜0.01，表明切莖接種法的發(fā)病率極顯著地高于手指摩擦接種法。

2．2切莖接種法與田間自然感病法對(duì)SrMV-HH1抗性鑒定結(jié)果比較

比較11個(gè)甘蔗品種材料生長期切莖接種法和田問自然感病法對(duì)SrMV-HH1的抗性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)：兩種方法發(fā)病率呈正相關(guān)，且相關(guān)程度極密切，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 7；根據(jù)1．3．1的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，11個(gè)材料兩種方法鑒定所得的抗病性和抗病等級(jí)結(jié)果完全一致，說明切莖接種法鑒定結(jié)果能真實(shí)反映甘蔗品種材料的自然抗感性，因而可以替代田間自然感病法鑒定。

3小結(jié)與討論

甘蔗抗花葉病鑒定是甘蔗抗病育種的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而室內(nèi)人工接種鑒定甘蔗對(duì)花葉病的抗性是抗花葉病鑒定的一個(gè)重要組成部分，具有快速和鑒定材料數(shù)量不受限制，環(huán)境條件可人為控制，可以滿足大規(guī)模篩選抗源材料的優(yōu)點(diǎn)。室內(nèi)人工接種鑒定可大批量篩選抗源、使育種工作者及時(shí)了解掌握育種材料的抗感性，從而合理選配親本組合、選育出抗病優(yōu)良品種供生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。由于目前常用的兩種室內(nèi)人工接種方法(噴霧接種法、手指摩擦接種法)都需要在接種前用手工搓揉蔗葉制造傷口，因不易掌握搓揉力度，往往導(dǎo)致搓揉傷口不均勻，從而使接種后花葉病發(fā)病不均勻，致病性不穩(wěn)定，影響鑒定結(jié)果；此外，甘蔗葉片表面布滿毛群，葉緣鋸齒尖利，人工摩擦(搓揉)易劃傷手，也給具體操作帶來困難。

本研究研制出的甘蔗仡葉病接種新技術(shù)－甘蔗生長期切莖接種法，通過和常用的接種技術(shù)比較，具有以下特點(diǎn)：(1)接種后甘蔗花葉病發(fā)病顯著、靈敏度高，可以有效區(qū)分不同甘蔗品種(寄主)之間對(duì)病害的抗感性；(2)運(yùn)用切莖后在切口處點(diǎn)病毒液的接種方法，制造的傷口均勻，接種病毒量一致、接種后發(fā)病均勻、結(jié)果穩(wěn)定性好；(3)由于帶毒收砍工具(蔗刀等)交叉感染是甘蔗花葉病傳播的主要途徑，而生長期切莖接種法與此種傳播方式很相似，因此鑒定結(jié)果更接近于田間自然感病結(jié)果；(4)生長期切莖接種法快速簡便，不用人工搓揉甘蔗葉片，不易劃傷手，因而可操作性強(qiáng)、接種工效高。因此可以對(duì)大批量材料進(jìn)行鑒定和篩選，為育種和生產(chǎn)部門提供更多更廣泛的抗源材料。