李利斌 劉開(kāi)昌 李現(xiàn)剛

摘 要:利用比較基因組學(xué)的方法從玉米的基因組中鑒定出三個(gè)新的SnRK2基因,并對(duì)這三個(gè)基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、蛋白基序、遺傳進(jìn)化以及上游順式調(diào)控元件進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步研究它們?cè)谟衩啄婢硲?yīng)答中的功能和利用它們進(jìn)行玉米分子育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:玉米;SnRK2基因;比較基因組學(xué);特征分析

中圖分類號(hào):Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2009)12-0007-05

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常遇到不良的環(huán)境條件如干旱、鹽脅迫、低溫或高溫的影響。為了生存,植物進(jìn)化出復(fù)雜的生理和遺傳機(jī)制來(lái)感受外部刺激并對(duì)逆境做出響應(yīng)[24]。闡明植物逆境脅迫的抗性機(jī)制和提高作物在各種脅迫條件下的抗性水平是各國(guó)科學(xué)家研究的主要目標(biāo)。已有研究表明,植物SNF1相關(guān)蛋白激酶家族基因參與了植物的多種逆境響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[2～4,6,7,9,14,21,23,25]。根據(jù)核酸和蛋白序列相似性,植物中的SNF1相關(guān)蛋白激酶基因分為三個(gè)家族:SnRK1、SnRK2和SnRK3[12]。其中,SnRK1和動(dòng)物中AMPK基因同源,主要參與碳代謝和能量代謝;SnRK2和SnRK3為植物特有,主要參與對(duì)環(huán)境因素如干旱和鹽脅迫等的應(yīng)答過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明,SnRK2家族基因在植物脫落酸(Abscisic acid, ABA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透脅迫響應(yīng)、氣孔開(kāi)閉、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收以及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。例如,擬南芥AtSnRK2.6/OST1可以和ABI(ABA不敏感型突變體)互作來(lái)整合ABA和滲透脅迫的信號(hào),正向調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉[1,19,26]。最近研究發(fā)現(xiàn)AtOST1在擬南芥中對(duì)于防止細(xì)菌從氣孔的入侵是必需的[18]。對(duì)AtSnRK2.10的研究顯示,它能夠磷酸化擬南芥和水稻中的脫水素蛋白,而且可以和磷脂酸結(jié)合調(diào)控逆境反應(yīng)[22]。而AtSnRK2.8/AtSnRK2C與代謝有關(guān),而且在缺鉀條件下下調(diào)表達(dá),植株生長(zhǎng)明顯下降,而過(guò)量表達(dá)AtSnRK2.8可顯著增強(qiáng)擬南芥植株在干旱脅迫下的抗性和生長(zhǎng)[18,20]。衣藻的SnRK2.1和擬南芥的AtSnRK2.3在調(diào)節(jié)硫饑餓條件下的基因表達(dá)和代謝反應(yīng)起到重要作用[11,13],而且AtSnRK2.2和AtSnRK2.3在種子萌發(fā)、根系生長(zhǎng)及幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要功能[7]。而AtSnRK2.9在缺磷條件下誘導(dǎo)表達(dá),突變體研究表明AtSnRK2.9對(duì)擬南芥生物量和種子產(chǎn)量形成具有重要作用[10]。蠶豆的AAPK基因可以通過(guò)磷酸化RNA結(jié)合蛋白AIPK1來(lái)調(diào)節(jié)脫水素基因的表達(dá)和逆境響應(yīng)[16,17]。麥類的PKABA1與 ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[11],小麥的W55a參與多種逆境應(yīng)答[23]。研究還發(fā)現(xiàn),SnRK2家族不同成員對(duì)ABA和滲透脅迫的響應(yīng)有所不同,它們?cè)诿{迫條件下可以被磷酸化和激活,并優(yōu)先磷酸化bZIP類的轉(zhuǎn)錄激活子,如擬南芥中的AREB1和水稻的TRAB1/ABFs,從而調(diào)節(jié)它們的活性和下游基因的表達(dá)[5, 8,15]。另外,活化的SnRK2蛋白可以自身磷酸化,而且在ABA和滲透脅迫條件下SnRK2被磷酸化的機(jī)制有所不同[4,14]。

玉米是目前世界上第一大作物,我國(guó)第二大作物。人們圍繞玉米的抗旱生理和遺傳機(jī)制及品種抗旱性改良做了大量的研究工作。盡管SnRK2基因在植物滲透脅迫反應(yīng)和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要功能,但關(guān)于玉米SnRK2基因的研究很不充分[27,28]。通過(guò)生物信息學(xué)分析,本試驗(yàn)鑒定出三個(gè)新的玉米SnRK2基因,對(duì)它們的基因結(jié)構(gòu)、蛋白基序、啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析,并對(duì)它們與擬南芥和水稻的SnRK2基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析,為進(jìn)一步研究這些基因在玉米中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

用已克隆的水稻SnRK2基因序列搜索各類公共數(shù)據(jù)庫(kù),尋找玉米的SnRK2序列,通過(guò)NCBIblastX進(jìn)行序列比對(duì)和在MaizeGDB中進(jìn)行EST搜索比對(duì),確定玉米SnRK2基因及其編碼序列。利用Mega 4.1對(duì)這些基因及擬南芥和水稻的SnRK2基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,擬南芥和水稻的SnRK2基因序列號(hào)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。利用PlantsP Feature Scan對(duì)玉米SnRK2基因編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。利用Maizesequence中的結(jié)果和SnRK2基因所在玉米基因組克隆BAC的信息對(duì)它們進(jìn)行染色體定位。通過(guò)SnRK2編碼區(qū)和基因組序列的比對(duì)來(lái)顯示基因外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)組成。根據(jù)編碼區(qū)序列和其所在BAC的序列得到各個(gè)SnRK2基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)及上游序列。利用PLANTCARE對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的順式反應(yīng)元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米SnRK2新基因的鑒定和特征分析

通過(guò)獨(dú)立的序列搜索和分析,作者在玉米基因組中找到三個(gè)SnRK2基因,分別位于基因組克隆AC207670、AC197912和AC214763中。根據(jù)它們所在基因組克隆的定位信息,確認(rèn)這三個(gè)基因?yàn)樾碌腟nRK2基因,與王國(guó)英研究組報(bào)道的11個(gè)玉米SnRK2基因和鄒華文等報(bào)道的ZmSPK1不同[27,28]。序列分析發(fā)現(xiàn)ZmSPK1與王國(guó)英研究組報(bào)道的ZmSnRK2.6一致。為統(tǒng)一起見(jiàn),作者將這三個(gè)新基因分別命名為ZmSnRK2.12、ZmSnRK2.13和ZmSnRK2.14。它們?cè)谌旧w上的分布和序列結(jié)構(gòu)特征見(jiàn)表1和圖1。這三個(gè)基因分別位于玉米的5號(hào)或4號(hào)染色體上,分別含有5個(gè)或8個(gè)內(nèi)含子。序列分析發(fā)現(xiàn)在ZmSnRK2.14的第六和第七個(gè)外顯子之間存在一個(gè)8 460 bp的內(nèi)含子,這個(gè)內(nèi)含子包含一個(gè)5 000 bp左右與水稻的多聚蛋白類似的轉(zhuǎn)座子序列。在GenBank中, 它們都有相應(yīng)的cDNA序列,說(shuō)明這些基因都是可表達(dá)的基因。

蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表2),玉米的這三個(gè)基因預(yù)測(cè)編碼的蛋白都含有激酶結(jié)構(gòu)域、ATP-結(jié)合區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)和三個(gè)潛在的豆蔻?；稽c(diǎn)。另外,ZmSnRK2.12和ZmSnRK2.13具有天冬氨酸富含區(qū),而ZmSnRK2.12還具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。這說(shuō)明三個(gè)新的玉米SnRK2蛋白具有ser/thr蛋白激酶的結(jié)構(gòu)特征,可能被豆蔻?；揎椪{(diào)節(jié)。

2.2 玉米SnRK2新基因的序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將三個(gè)玉米SnRK2新基因與水稻、擬南芥的SnRK2基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析和序列比對(duì)。結(jié)果(圖2、3)表明,ZmSnRK2.12/OsSAPK10、ZmSnRK2.13/OsSAPK8、ZmSnRK2.14/OsSAPK6可能為直系同源基因,它們編碼的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的序列一致性分別為96.50%、94.19%、98.05%。已有研究表明,OsSAPK6可通過(guò)磷酸化ABF類轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)ABA的應(yīng)答[5],而OsSAPK8和OsSAPK10的表達(dá)受ABA和滲透脅迫調(diào)節(jié),而且可被磷酸化調(diào)節(jié)[14]。另外,三個(gè)玉米SnRK2新基因與擬南芥SnRK2的進(jìn)化分析表明,ZmSnRK2.12/AtSnRK2.6、ZmSnRK2.13/AtSnRK2.6、ZmSnRK2.14/AtSnRK2.4、ZmSnRK2.14/AtSnRK2.10可能為直系同源基因, 它們編碼的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的序列一致性分別為91.83%、 90.70%、 87.94%、 86.77%。AtSnRK2.6在調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要功能,而且能夠通過(guò)磷酸化ABF類轉(zhuǎn)錄因子來(lái)行使功能[1,19,26],防止細(xì)菌從氣孔入侵?jǐn)M南芥[18]。對(duì)AtSnRK2.10的研究顯示,它能夠磷酸化擬南芥中的脫水素蛋白,還可與磷脂酸結(jié)合調(diào)控脅迫應(yīng)答反應(yīng)[22]。根據(jù)進(jìn)化分析和水稻、擬南芥SnRK2基因功能研究的結(jié)果,推測(cè)玉米的SnRK2.12具有與AtSnRK2.6和OsSAPK10類似的功能,SnRK2.13與AtSnRK2.6和OsSAPK8的功能相似,而SnRK2.14與OsSAPK6和擬南芥的AtSnRK2.4/AtSnRK2.10功能相似。

2.3 玉米SnRK2新基因的順式反應(yīng)元件預(yù)測(cè)

高等植物基因的表達(dá)主要是順式反應(yīng)元件和反式作用因子相互作用的結(jié)果。分析基因啟動(dòng)子序列中順式反應(yīng)元件的類型可以為研究基因的功能提供一定線索。本研究在得到三個(gè)玉米新基因的基因組序列后,對(duì)起始密碼子ATG上游2 000 bp序列所包含的順式元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。 結(jié)果(表3)表明, 3個(gè)玉米SnRK2新基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)不同逆境和激素應(yīng)答順式作用元件: SnRK2.12擁有脫落酸應(yīng)答元件ABRE和Motif-IIb、脫水應(yīng)答元件DRE、熱脅迫應(yīng)答元件HSE、茉莉酸甲酯(MeJA)應(yīng)答元件CGTCA-motif、赤霉素(GA)應(yīng)答元件GARE-motif、生長(zhǎng)素應(yīng)答元件TGA-element和TGA-box、生物鐘應(yīng)答元件以及病原物和逆境應(yīng)答元件W-box; SnRK2.13擁有脫落酸應(yīng)答元件ABRE、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件、低溫應(yīng)答元件、生長(zhǎng)素應(yīng)答元件、生物鐘應(yīng)答元件、赤霉素應(yīng)答元件P-box、水楊酸應(yīng)答元件; 而SnRK2.14的順式元件較少,僅存在茉莉酸甲酯應(yīng)答元件、生物鐘應(yīng)答元件、水楊酸應(yīng)答元件、干旱應(yīng)答元件MBS和生物鐘應(yīng)答元件。這說(shuō)明三個(gè)玉米SnRK2新基因可能參與多種逆境和激素信號(hào)的應(yīng)答,在植物逆境響應(yīng)過(guò)程中具有重要功能,值得深入探討。

3 小結(jié)

本研究利用比較基因組學(xué)的方法,從玉米基因組中鑒定出三個(gè)新的SnRK2基因。序列相關(guān)信息分析表明,它們不同于以前報(bào)道的玉米SnRK2基因。這樣在玉米的基因組中至少存在14個(gè)SnRK2基因,而在水稻的基因組中目前確認(rèn)有10個(gè)SnRK2基因。這可能與玉米擁有較大的基因組有關(guān)。進(jìn)化和順式元件分析表明, 這三個(gè)新的玉米SnRK2基因可能在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境應(yīng)答過(guò)程中具有重要功能。它們的表達(dá)調(diào)控、在基因網(wǎng)絡(luò)中的位置和功能,以及在玉米抗逆分子育種中的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn):

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