賀素典　郭繼豐

[摘要] 目的：探討兩種方法在結(jié)核分枝桿菌耐藥性快速檢測的應(yīng)用可行性。方法：應(yīng)用直接法與傳統(tǒng)法進(jìn)行耐藥試驗(yàn)，比較兩者的耐藥結(jié)果。結(jié)果：與傳統(tǒng)法耐藥管培養(yǎng)結(jié)果比較，涂片≤2+的痰標(biāo)本的低濃度耐藥試驗(yàn)直接法的結(jié)果RFP、INH、EMB耐藥性符合率分別為28.6%、50.0%、12.5%，耐藥性總符合率為30.4%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：直接法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥試驗(yàn)是可行的，對臨床上肺結(jié)核病人耐藥性的快速檢測具有一定價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；肺結(jié)核；直接耐藥試驗(yàn)；耐藥性檢測

[中圖分類號]R378.91+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B [文章編號]1674-4721（2009）02（a）-021-01

結(jié)核分枝桿菌高耐藥是結(jié)核病病情惡化的重要原因，已成為當(dāng)前結(jié)核病臨床和防治工作的難題。常規(guī)藥敏試驗(yàn)方法，如用羅氏培養(yǎng)基等做直接或間接藥敏試驗(yàn)，由于受MTB生長緩慢的影響而費(fèi)力、費(fèi)時(shí)(需6～8周或更長時(shí)間)，不能滿足臨床需要，目前已較少使用。故目前急需一種簡單、快速、價(jià)廉、靈敏、特異的檢查方法。為了指導(dǎo)臨床用藥，本文實(shí)際比較了結(jié)核分枝桿菌耐藥性不同檢測方法的效果，現(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1材料

結(jié)核分枝桿菌共35株(份)，均自我院住院和門診患者的痰、胸腔積液、腹腔積液等標(biāo)本中分離，經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)噻吩，2-羧酸肼(TCH)鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌。痰標(biāo)本處理按規(guī)定要求進(jìn)行痰標(biāo)本處理[1]。

1.2檢測方法

直接法：取經(jīng)前處理的標(biāo)本液0.1 ml，均勻接種于各培養(yǎng)基斜面上，每份標(biāo)本按每個(gè)藥物濃度管2支，不含藥物的對照管2支、分離培養(yǎng)管2支進(jìn)行接種。接種后放37℃孵箱培養(yǎng)，2周內(nèi)每天觀察1次，2周后每周觀察1次，藥敏試驗(yàn)管至4周報(bào)告藥敏結(jié)果。傳統(tǒng)法：取上述直接法分離培養(yǎng)基上生長的菌落，采用傳統(tǒng)法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。按傳統(tǒng)規(guī)定藥敏試驗(yàn)結(jié)果觀察報(bào)告結(jié)果。

1.3耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)

以含藥培養(yǎng)基無菌落生長者報(bào)告敏感(S)，有菌落生長≥20個(gè)者報(bào)告耐藥(R)。

2結(jié)果

2.1痰涂片結(jié)果

直接法培養(yǎng)的對照管有菌落生長的共34例，占97.1%，其中結(jié)果報(bào)告3+以上的有25例，2+及以下的有8例，陰性的1例。以直接法對照管培養(yǎng)結(jié)果與傳統(tǒng)法對照管培養(yǎng)結(jié)果比較，涂片≤2+，對照管培養(yǎng)結(jié)果≥3+的標(biāo)本的符合率為52.5%；涂片≥3+，對照管結(jié)果≥3+的痰標(biāo)本的符合率為100%。

2.3耐藥性結(jié)果

與傳統(tǒng)法藥敏管培養(yǎng)結(jié)果比較，涂片≤2+的痰標(biāo)本的低濃度藥敏試驗(yàn)直接法的結(jié)果RFP、INH、EMB耐藥性符合率分別為28.6% 、50.0% 、12.5%，耐藥性總符合率為30.4%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3討論

隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)展，抗結(jié)核藥物的耐藥機(jī)制逐漸被闡明[2]。利福平(RFP)通過特異地與依賴DNA的RNA聚合酶β亞單位(rpoβ)結(jié)合，抑制RNA聚合酶活性，從而干擾mRNA的轉(zhuǎn)錄，阻礙蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮抗菌作用。當(dāng)rpoβ基因發(fā)生一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的突變、缺失時(shí)，就會對RFP產(chǎn)生耐藥。95%左右的RFP耐藥菌株的產(chǎn)生都是由于rpoβ基因發(fā)生改變所致。

檢測耐藥性主要包括絕對濃度法、抗性比率法和比例法[3]。但以往使用的方法都較費(fèi)時(shí)，不能準(zhǔn)確定量，只能對結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行分析。近幾年改良的直接法用于檢測的同時(shí)，也被用于耐藥性檢測。為了加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，對那些涂片經(jīng)抗酸染色檢查陽性的標(biāo)本可直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，只需7～14 d即可得到結(jié)果，且可較準(zhǔn)確定量。本文直接法的對照管、耐藥管培養(yǎng)結(jié)果與傳統(tǒng)法相應(yīng)的培養(yǎng)管的培養(yǎng)結(jié)果比較顯示涂片含菌量≥3+的痰標(biāo)本，兩者的培養(yǎng)結(jié)果非常相符，兩者的對照管培養(yǎng)結(jié)果≥3+符合率為100%，而涂片含菌量≤2+的痰標(biāo)本，兩者的培養(yǎng)結(jié)果的相符性較差，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

同時(shí)隨著科學(xué)技術(shù)方法的發(fā)展，PCR技術(shù)已大量應(yīng)用與檢測耐藥性，PCR技術(shù)最初僅限于對臨床痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌特有的擴(kuò)增目標(biāo)包括插入和重復(fù)序列、各種蛋白編碼基因和核糖體RNA等設(shè)計(jì)特異引物，最后根據(jù)擴(kuò)增出的目的片段來判斷陽性結(jié)果。PCR技術(shù)的應(yīng)用無疑大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且操作簡便，但是單純通過擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠板上的遷移判定擴(kuò)增的陽性與否還是不夠可靠，同時(shí)由于擴(kuò)增抑制物亦存在有假陰性結(jié)果。實(shí)際上，即使片段長度的等同也不應(yīng)認(rèn)為擴(kuò)增產(chǎn)物就是目的片段，而應(yīng)在片段長度和序列同源性兩個(gè)方面同時(shí)得到確認(rèn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國防癆協(xié)會.結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國防癆雜志,1996,18(1):28.

[2]王書杭，李養(yǎng)群，牛國強(qiáng).住院肺結(jié)核患者初治耐藥動(dòng)態(tài)監(jiān)測[J]．臨床肺科雜志，2006，11(2)：239-241．

[3]黃小玲，羅道泉，歐陽資章，等．深圳市抗肺結(jié)核藥物的耐藥評價(jià)[J].中國藥房，2005，16(14)：1084-1085．

（收稿日期：2008-11-25）