王曉南　高　鵬　王麗環(huán)

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035） お

摘 要：在大腸桿菌中利用基因重組技術獲得高效表達的人過氧化氫酶(catalase，CAT)，即利用pMAL-c2x構建了從人cDNA文庫中獲得的CAT編碼基因融合表達載體，并進行了表達。使融合表達獲得可溶性蛋白，為后續(xù)重組酶性質的研究和開發(fā)利用奠定了基礎。

關鍵詞：大腸桿菌；人過氧化氫酶基因；融合表達；表達

中圖分類號：R378.2+1文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）03-0005-02

1 過氧化氫酶的功能與來源

在生物體的新陳代謝中，細胞有氧呼吸所消耗的O2約10%被還原成H2_O2，而其很容易被細胞中各種還原劑還原成OH-和極毒的自由基?OH，它能氧化與它接觸的幾乎所有細胞組分，引起衰老、癌變及其它病癥。

但生物體有自己的保護機制，體內存在的過氧化氫酶(catalase，CAT)能有效地催化細胞中產生的高濃度H2_O2(2H2_O2→O2+2H2_O)，使H2_O2不至于與細胞有氧代謝中產生的超氧陰離子自由基O-2?進一步生成羥自由基?OH，從而防止自由基對細胞的損傷^[1]。

此外，CAT還具有一些其它的生理功能。它除了可調節(jié)體內H2_O2水平外，還可充當Hb和其它含巰基蛋白質的保護劑。主要與細胞內線粒體及過氧體結合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脫氫酶相偶聯(lián)，從而迅速分解細胞代謝中產生的毒性物H2_O2，起到解毒與保護巰基酶、膜蛋白等作用^[2]。

商品化的過氧化氫酶主要來源于牛肝、微球菌和黑曲霉^[3]，多應用于工業(yè)生產^[4]。而對醫(yī)藥和保健來說，人源的CAT應用價值更高。本研究利用基因重組技術將人CAT基因分別構建了融合和非融合表達載體，在大腸桿菌中實現(xiàn)了有生物活性的表達，為其開發(fā)利用奠定了基礎。

2 人過氧化氫酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達

2.1 材料

人cDNA文庫（購自PROMEGA公司）；

菌種E.coli TB1、JM109，質粒pMAL-c2x、pBV221，抗MBP抗血清，Amylose Resin（購自NEB公司）；

TaqDNA聚合酶，限制性內切酶XbaⅠ、PstⅠ、NcoⅠ，DNA回收試劑盒，DL3000 DNA Marker，pMD19-T Vector（購自TaKaRa公司）；

Factor Ⅹa（購自BioLabs公司）；

二抗（羊抗兔），（購自北京百靈克生物公司）。

2.2 方法

2.2.1 CAT基因的獲得

根據(jù)Genbank上登錄的人CAT基因NM-001752，利用primer5軟件在基因全長范圍設計最佳引物對，正向為：5-CGCACGCTATGGCTGACAG-3，反向為：5-TGATGAGCGGGTTACACGG-3，以人cDNA文庫為模板進行PCR。擴增后的產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，克隆至pMD19-T Vector，由北京華大基因研究中心測序。2.2.2 CAT表達載體的構建

根據(jù)閱讀框架設計兩對帶酶切位點的引物，并以上述經測序驗證的陽性質粒為模板進行PCR擴增。其中引物對1，正向為：5-GCTCTAGAATGGCTGACAGCCG-3，反向為：5-AACTGCAGTCACAGATTTGCCTTC-3，并分別帶有XbaⅠ酶切位點、PstⅠ酶切位點。用限制性內切酶XbaⅠ、PstⅠ雙切質粒pMAL-c2X及引物對1的PCR擴增產物，分別回收目的片段與線性化載體片段后，用T4DNA連接酶連接過夜，構建融合表達載體pMAL-c2x-CAT并轉化至E.coli TB1。

2.2.3 CAT基因的誘導表達

將37℃振蕩過夜的重組菌按1％量轉接到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)6h，加入IPTG至終濃度1mmol/L誘導12h。超聲破菌后，上清液用Amylose Resin進行親和層析純化，SDS-PAGE和Western blotting（一抗：抗MBP抗血清，二抗：羊抗兔）檢測MBP-CAT表達情況。

3 結果

3.1 CAT基因的擴增

通過PCR擴增可以從人cDNA文庫直接獲得CAT基因，但由于CAT基因較長（約1.7kb），采用一般的PCR反應條件較難獲得。本研究在沒有改變普通Tag酶的情況下，適當延長了延伸時間，結果獲得了較理想的結果。如圖1A所示，當延伸時間為1min時，沒有擴增產物，但延伸時間改為2min和3min后，擴增產物隨延伸時間的增加而增加。將獲得的擴增產物克隆到T載體后，測序結果經BLAST分析表明，獲得的目的片段為人過氧化氫酶基因。以此測序重組子為模板進行的二次PCR反應，獲得僅含編碼序列的片段。由于此反應的模板單一，延伸1min與3min擴增效果相同(圖1B)。

圖1 嵌套式PCR擴增CAT基因的瓊脂糖凝膠電泳

A.以人cDNA文庫為模板，改變不同延伸時間獲得的PCR擴增產物

1:延伸時間為1min;2:延伸時間為2min;3:延伸時間為3min;M:DL3000 DNA Marker。

B.以第一次擴增產物為模板， 改變不同延伸時間獲得的PCR擴增產物。

M:DL3000 DNA Marker;1:延伸時間為1min;2:延伸時間為2min;3:延伸時間為3min。

3.2 CAT基因在大腸桿菌中的表達

將CAT編碼基因片段克隆入pMAL-c2x載體，構成pMAL-c2x-CAT重組質粒。其中CAT基因的上游為MBP基因，它與CAT基因以融合形式表達。因MBP分子量為42kD，其與59kD的CAT融合，表達蛋白應為100kD左右。如圖2所示，將pMAL-c2x-CAT重組質粒轉化E.coli TB1，分別用37℃、28℃、20℃三種溫度進行誘導，破菌處理后SDS-PAGE檢測，顯示表達區(qū)帶出現(xiàn)在略高于97400的標準蛋白位置上，并且均為可溶性蛋白。相比之下以20℃誘導溫度為獲得最佳表達量。Western bloting檢測(與抗MBP抗體反應)，結果顯示該條區(qū)帶確實是融合蛋白MBP-CAT（圖3）。

圖2 SDS-PAGE檢測MBP-CAT在大腸桿菌中的表達

M:低分子量標準蛋白;1～4，5～8，9～12分別為37℃，28℃，20℃三個溫度梯度下的未誘導樣品、IPTG誘導樣品、超聲破菌后的上清、超聲破菌后的沉淀。

圖3 Western blotting檢測MBP-CAT在大腸桿菌中的表達

M:低分子量標準蛋白; 1: pMAL-c2x- CAT重組子超聲破菌的上清轉膜后考馬斯亮藍染色;2:pMAL-c2x-CAT重組子超聲破菌的上清與抗MBP抗血清反應;3:pMAL-c2x陰性對照菌的上清與抗MBP抗血清反應。

4 討論

本研究利用嵌套引物和增加延伸時間，順利獲得目的基因。由于目的片段較長（1.7kb），當使用普通Taq酶時，僅采用一般的PCR反應條件不太容易直接獲得目的片段，所以本實驗適當延長嵌套式PCR第一次擴增反應的延伸時間，保證目的片段得到充分延伸。實驗證明，在常規(guī)延伸時間（1min）條件下不能獲得目的片段，但當將延伸時間加長（2min、3min）即可獲得目的片段，而且隨時間的延長獲得的擴增產物更多。在進行嵌套式PCR反應的第2次擴增中，由于模板單一，所以常規(guī)延伸時間（1min）就能保證目的片段的充分延伸。

在表達過程中，本研究選擇了融合表達（pMAL-c2x），分別選擇37℃、28℃、20℃作為不同誘導溫度對pMAL-c2x-CAT重組菌進行誘導表達。實驗發(fā)現(xiàn)，盡管不同溫度的表達產物都為可溶性蛋白，但隨著溫度的降低，目的蛋白的表達量逐步增加，說明低溫誘導有利于蛋白的表達，但由于CAT片段較長，表達過程中會出現(xiàn)部分降解。

本研究分別構建了人CAT基因的融合表達載體，在大腸桿菌中實現(xiàn)了表達，為以后重組人過氧化氫酶的進一步開發(fā)利用奠定了基礎。

參考文獻：

［1］ 彭志英，蔣黎.紫外速率直接法測定過氧化氫酶活性［J］.華西醫(yī)學，1995（10）：4-8.

［2］ 王坤.實用診斷酶學［M］.重慶：科學技術文獻出版社重慶分社，1989：273.

［3］ 王凡強，王正祥，邵蔚藍，等.重組大腸桿菌熱穩(wěn)定性過氧化氫酶的純化及性質研究［J］.微生物學報，2002，42(3):348-353.

［4］ Dhaese，Patrick. Catalase，an enzyme with growing industrial potential［J］.Chim.Oggi，1996，14（1）;19-20.

（責任編輯：曾楚華）