許春英 李逢慧 羅 超

摘要為了建立檢測建蘭花葉病毒的快速實用分子生物學技術,該研究借助新興的環(huán)介導等溫擴增技術,建立了一種靈敏、特異、快速的分子生物學檢測方法——體外等溫擴增檢測方法。設計了4條針對目的基因的6個位點的特異性引物,建立了一套從核酸抽提到LAMP檢測快速檢測方法。所建立的檢測方法比RT-PCR更靈敏;且具有特異性,操作簡單,不需要復雜的儀器,肉眼可直接觀察檢測結果。適合基層和現(xiàn)場檢測。

關鍵詞建蘭花葉病毒;反轉錄聚合酶鏈反應;環(huán)介導等溫擴增技術

中圖分類號 S432.4+1 文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)08-0011-02

建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)為馬鈴薯×病毒屬(Potexvirus)成員,是東南亞最常見蘭花病毒,為迄今從蘭花上分離到的病毒中分布最廣、危害最嚴重的病毒病之一。CyMV單獨侵染能使蘭科植物產生花葉或褐色斑,但該病毒一旦同齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)復合感染,將導致植株矮化,開花小而少,花期縮短,觀賞價值大為下降,經濟效益受到極大影響。因此,我國植物檢疫部門將此病毒列為我國3類危險性病毒[1-3]。PCR方法逐漸成為檢疫性病害快速靈敏的檢測方法,在國際上已被廣泛接受和應用[4]。在國內,潘俊松等和周國輝等分別報道了海南和廣東地區(qū)蘭花中CyMV的反轉錄聚合酶鏈式反應(RT—PCR)檢測方法[5,6],但是還沒有有關CyMV的環(huán)介導等溫檢測方法的報道。

環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[7]技術依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA聚合酶,在等溫條件下可高效、快速、特異地擴增靶序列。本研究根據(jù)建蘭花葉病毒部分基因序列設計了一套LAMP特異性引物,建立了檢測建蘭花葉病毒的一種新型、快速、實用、靈敏的建蘭花葉病毒檢測技術。

1材料與方法

1.1病毒

CyMV病毒毒源由本實驗室分離并保存,疑似病例采自湖南省植物園。

1.2試劑

CyMV病毒反轉錄試劑盒購自TAKARA公司,Bst DNA聚合酶大片段、dNTP、ThermoPol buffer、硫酸鎂為北京紐英倫NEB生物技術有限公司產品,100bp DNA marker、50×TAE緩沖液為北京索萊寶科技有限公司產品。特異性引物由上海英駿公司合成,引物序列如下:

F3——CCAAGAGTGCTACCCTGCT

B3——GACGGCATCGAAGA AGTCAA

FIP——CCACGAAGATCTGCGCTGCAAG-TGGTT-CCTGCCCTACGAA

BIP——ATGCTGGCTACTAACGATCCGC-CCGGG-TATCCTCCTGGAA

1.3RNA的提取

取100 mg 病葉加入適量PBS緩沖液研磨,液體收集于離心管中。離心后取500μL上清液于另一離心管中,依次加入700μLTrizol、250μL氯仿,混勻后靜置5min,離心取700 μL上清液到無Rnase離心管中,加入700μL異丙醇,-20℃靜置10min。離心后棄上清液,沉淀經75 %乙醇洗滌2次后,溶解于200μL TE 中備用。

1.4RT-PCR

cDNA合成按照試劑盒使用說明進行。25μL PCR體系如下:10×buffer2.5μL,dNTP4μL,引物CyMV F3、CyMV B3各1μL,cDNA 5μL,Taq酶0.5μL,ddH2O 11μL。PCR程序:94℃變性5min,94℃變性30s,60℃變性30s,72℃變性30s,30個循環(huán);最后72℃延長10min。取反應產物5μL 按常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳測定擴增條帶大小。

1.5LAMP反應體系的建立

建蘭花葉病毒RT-LAMP的反應體系為25μL,各組分的量為:F3和B3各0.2μmol/L、FIP和BIP各1.2μmol/L、dNTP 400μmol/L、betaine 1μmol/L、MgSO4 3mmol/L、10×Th-ermopol buffer 2.5μL、Bst DNA聚合酶5U、模板2μmoL,加雙蒸水至25μL。水浴鍋調至溫度62℃后,將含RT-LAMP反應液的PCR反應管置于水浴鍋內等溫擴增1h。

1.5.1建蘭花葉病毒LAMP檢測。反應結束后,加入1μL SYBRGreen I染料,觀察LAMP反應液是否發(fā)生顏色變化,再將PCR反應管置于紫外燈下照射,觀察是否有強烈的熒光產生。取10μL建蘭花葉病毒LAMP擴增產物,于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢查。

1.5.2LAMP的敏感性試驗。將抽提的CyMV模板進行10倍稀釋成1.0×10-1~1.0×10-9等9個稀釋度。用所建立的LAMP檢測方法和RT-PCR檢測方法進行靈敏性比對試驗。

1.5.3LAMP特異性試驗。抽提建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒等病毒核酸,按照所建立的建蘭花葉病毒LAMP檢測方法,進行特異性試驗。

2結果與分析

2.1建蘭花葉病毒LAMP檢測及RT-PCR檢測

在25μL反應體系中,于PCR反應管中加入建蘭花葉病毒模板,同時設置陰性對照,于恒溫水浴鍋上進行LAMP擴增。擴增結束后肉眼觀察即可發(fā)現(xiàn)較反應前混濁,離心后可見少許白色沉淀。向反應管中加入SYBR Green I染料,反應液呈現(xiàn)明顯的翠綠色,而陰性對照則為淡橙色;將加入染料后的各反應管置紫外燈下照射,加入建蘭花葉病毒模板的反應液發(fā)射出強烈的綠色熒光。瓊脂糖凝膠電泳檢測后,加入建蘭花葉病毒模板的反應液,結果有特異性的梯狀條帶,陰性對照則無條帶出現(xiàn)(見圖1)。取5μL RT-PCR擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)預期的230bp的特異性條帶(見圖2)。

2.2LAMP敏感性試驗

反復試驗表明,建蘭花葉病毒LAMP檢測模板濃度靈敏度為10-8,而PCR的靈敏度為10-6(見圖3)。

2.3LAMP特異性試驗

所建立的建蘭花葉病毒LAMP檢測方法可以在1h內檢測出建蘭花葉病毒,而將等溫擴增時間延長至2h,仍不能檢測出齒蘭環(huán)斑病毒、蘭花斑點病毒、蝴蝶蘭混雜病毒等病毒核酸。

2.4LAMP臨床試驗

將經過鑒定的建蘭花葉病料處理后,用所建立的建蘭花葉病毒LAMP檢測方法進行檢測,均可獲得陽性結果。

3討論

CyMV的傳播途徑主要有汁液、桃蚜和接觸。Zettler等認為,蘭花病毒病不種傳[8],但Wisler和Hu等的研究表明,CyMV可隨蝴蝶蘭種子傳播[9,10]。近幾年,隨著蘭花生產的發(fā)展、品種的引入,該病現(xiàn)已廣泛存在于全世界栽培蘭花的地區(qū),且?guī)Ф韭氏喈敻摺Ｐせ鸶韧ㄟ^ELISA對廣東省蘭花進行病毒檢測,結果從25.2% 樣品中檢測出CyMV[11],占所檢測品種的1/2,可見我國蘭花產業(yè)已經受到CyMV侵害。

CyMV的檢測技術包括癥狀觀察、電鏡觀察、血清學及分子生物學方法,其操作繁瑣且不同檢測方法的靈敏度及準確度相差明顯。高煥利等建立了CyMV的免疫捕扶反轉錄聚合酶鏈式反應(IC—RT—PCR),可檢測的最低病毒含量為2.72×10-7g/mL[12],但其需要特殊的儀器,如PCR擴增儀或Real-time PCR擴增儀,無法滿足基層和現(xiàn)場檢測需求。

本試驗建立的建蘭花葉病毒LAMP檢測方法對cDNA模板稀釋至10-8仍能擴增出條帶,表明建蘭花葉病毒LAMP檢測方法的敏感性非常高,且反應時間短(1h),不需要昂貴的PCR儀,非常適合基層部門和養(yǎng)殖場使用,尤其適合現(xiàn)場檢測。當前,LAMP用于病毒、細菌、真菌如禽流感、新城疫、肝炎,以及沙門氏菌、大腸桿菌的檢測等,已經成為熱點。本研究使LAMP技術用于建蘭花葉病毒的檢測成為了可能,具有很高的實用價值。

Notomi等[7]設計LAMP的初衷是采用顏色或者沉淀變化直接觀察反應結果,Mori等[13]試驗數(shù)據(jù)表明,25μL LAMP反應體系可擴增形成超過10μg的DNA,而生成4μg以上的DNA釋放出的焦磷酸根即可達到形成沉淀所需的0.5mmol/L濃度,常規(guī)PCR反應中,焦磷酸根的濃度只能達到0.02mmol/L,而且在變性過程中還被還原為磷酸根,故離心沒有沉淀出現(xiàn)。在實際檢測中,比濁或者觀察沉淀的判定方法受引物二聚體的影響不大,因為其生成量不足以導致沉淀[14]。

4參考文獻

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(下轉第14頁)

(上接第12頁)

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