灰霉病菌抗藥性發(fā)生概況及機(jī)理研究進(jìn)展

于永學(xué) 王英姿

摘要綜述國內(nèi)外灰霉病菌抗藥性發(fā)生概況,總結(jié)了灰霉病菌抗藥性機(jī)理方面的研究報(bào)導(dǎo),并提出防止灰霉病抗藥性發(fā)生的相關(guān)建議。

關(guān)鍵詞灰霉病菌;抗藥性;機(jī)理;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)11-0117-02

近幾年灰霉病已成為影響保護(hù)地蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素,灰霉病對(duì)殺菌劑極易產(chǎn)生抗藥性,也成為生產(chǎn)上亟待解決的一大難題。掌握灰霉病菌的抗性發(fā)生現(xiàn)狀,了解其抗性機(jī)理,對(duì)防止抗性的發(fā)生,延長藥劑的使用壽命,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1灰霉病菌抗藥性發(fā)生概況

灰霉病菌具有繁殖快、遺傳變異大和適合度高等特點(diǎn),連續(xù)使用同一藥劑易產(chǎn)生抗藥性。目前,灰葡萄孢霉己對(duì)苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、N-苯氨基甲酸酯類和苯胺基嘧啶類殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。

自從1971年,Bollen和Scholten在荷蘭溫室中的仙客來上發(fā)現(xiàn)灰霉菌對(duì)苯來特的抗性菌株以來,美國、英國、法國、以色列、意大利等地的葡萄、草莓、番茄上的灰霉病菌也都相繼發(fā)生了抗藥性,使得苯并咪唑類殺菌劑的防效迅速下降[1,2]。我國使用該類殺菌劑己有多年歷史,1987年,葉鐘音等對(duì)從梅果上分離到的灰霉病菌菌株進(jìn)行紫外光誘導(dǎo)獲得對(duì)多菌靈的抗性菌株,其抗性水平很高[3]。同年周明國等在南京市郊發(fā)現(xiàn)個(gè)別灰霉病菌菌株已對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗藥性[4]。劉慧平等對(duì)山西各地188個(gè)灰葡萄孢霉菌株抗性監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)多菌靈產(chǎn)生嚴(yán)重抗性[5]。多菌靈抗性菌株其產(chǎn)孢能力并不比敏感菌株低,繼代培養(yǎng)抗性程度也不下降[6]。

二甲酰亞胺類殺菌劑屬于多作用位點(diǎn)的殺菌劑,病菌對(duì)它的抗性增長緩慢。Leroux(1977)首次得到了抗二甲酰亞胺類殺菌劑的灰霉病菌的突變體[7]。20世紀(jì)80年代,瑞典、新西蘭、意大利和加拿大發(fā)現(xiàn)抗性菌株[8,9]。2003年對(duì)山西灰霉病菌抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,灰霉病菌對(duì)腐霉利表現(xiàn)出低水平抗性[10]。江蘇蔬菜灰葡萄孢霉對(duì)腐霉利的田間抗性水平也大都屬低抗范圍[11]。研究認(rèn)為這類殺菌劑可能是特殊位點(diǎn)抑制劑,目標(biāo)真菌的抗性遺傳是由單基因決定的質(zhì)量遺傳,一次突變即可使抗性水平提高,且有穩(wěn)定的遺傳性[12-14]。其中腐霉利、撲海因之間存在正交互抗性,與苯并咪唑類和傳統(tǒng)的保護(hù)性殺菌劑之間無交互抗性。

Leroux和Gredt于1979年首先發(fā)現(xiàn)N-苯氨基甲酸酯類化合物燕麥靈(barbon)、氯苯胺靈(chlorprophan)和氯草靈(chlorbufam)防治灰霉病和青霉病與苯并咪唑類殺菌劑表現(xiàn)負(fù)交互抗性。1984年日本住友公司開發(fā)了殺菌劑乙霉威(Kato,1984),它與苯并咪唑殺菌劑存在負(fù)交互抗性,但使用不久后,即在意大利[15],以色列[13]、英國[9]等地,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了既抗多菌靈又抗乙霉威的灰霉病菌菌株。

1996年在法國和瑞士檢測(cè)到嘧霉胺的抗性菌株,此時(shí)距其使用僅2年時(shí)間。1994年,在用嘧菌環(huán)胺處理了4次的葡萄園田塊上采集了20個(gè)灰葡萄孢霉菌株,測(cè)定結(jié)果表明病菌對(duì)嘧菌環(huán)胺的敏感性都已經(jīng)下降了。在相鄰田塊中,灰葡萄孢霉的抗性頻率為10%~15%。由于2個(gè)田塊相隔很近,有可能是抗性菌株通過風(fēng)或雨水?dāng)U散的結(jié)果[16]。1993~1995年在瑞士,從不同程度上用過苯胺基嘧啶類殺菌劑的葡萄園中分離得到的303個(gè)灰葡萄孢霉菌株,離體檢測(cè)結(jié)果表明,其中有3株已表現(xiàn)出抗藥性[16]。中國于20世紀(jì)90年代末開始推廣使用苯胺基嘧啶類殺菌劑,目前已有抗藥性報(bào)道。紀(jì)明山等發(fā)現(xiàn)遼寧省保護(hù)地番茄灰霉病菌已對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生抗藥性,處于中抗水平,平均抗性頻率達(dá)22.9%[17]。

2灰霉菌抗性機(jī)理

自1994年對(duì)法國葡萄園實(shí)施抗藥性監(jiān)測(cè)以來,灰葡萄孢霉的田間種群中發(fā)現(xiàn)3種苯胺基嘧啶類抗性表現(xiàn)型(AniRl、AniR2和AniR3)。遺傳學(xué)分析顯示,對(duì)于每種表現(xiàn)型,其抗性分別是由主效基因Anil、Ani2或Ani3決定的。AniRl菌株在離體條件下對(duì)任意一種苯胺基嘧啶類殺菌劑都有中度至高度抗性;AniR2和AniR3菌株對(duì)苯胺基嘧啶類的抗性主要表現(xiàn)在芽管的伸長階段[18,19]。各種抗性表現(xiàn)型中,根據(jù)殺菌劑對(duì)萌發(fā)管伸長和菌絲生長的離體作用,共有3種主要的情況:各階段都表達(dá)抗性,即抗微管毒劑(Ben R1、BenR2),咪唑啉酮類(ImiR1)、苯胺基嘧啶類(AniR1)、羥基苯胺類(HydR3);主要對(duì)萌發(fā)管延長表達(dá)抗性,即多藥劑抗性表現(xiàn)型(AniR2、AniR3);對(duì)菌絲生長表達(dá)抗性,即羥基苯胺類(HydR2)。

田間發(fā)現(xiàn)了各種表現(xiàn)型,但只有顯示以上這兩階段的離體抗性。田間灰葡萄孢菌菌株主要存在3種抗性機(jī)理,即毒劑滲透性減弱、脫毒作用增強(qiáng)和毒性代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)換作用的減弱、靶標(biāo)位點(diǎn)敏感性降低。

2.1毒劑滲透性減弱

幾種殺菌劑以活性形式自灰葡萄孢菌菌絲釋出,并且在法國葡萄園檢測(cè)到多藥耐藥(MDR)基因表現(xiàn)型(AniR2、AniR3),這說明腺苷三磷酸結(jié)合暗盒(ABC)運(yùn)輸器參與殺菌劑抗性。該現(xiàn)象很可能基于ABC運(yùn)輸器的產(chǎn)生過剩,其也發(fā)生在灰葡萄孢菌的實(shí)驗(yàn)室突變種、指狀青霉[Pencilli-um digitatum(Pers)Sass]的天然菌株以及人類病原菌白假絲酵母[Candida albicans(Robin)Berkhour]對(duì)甾醇甲基抑制劑(DMIs)產(chǎn)生抗性的過程中。ABC運(yùn)輸器活性的特異性抑制劑可與抗性產(chǎn)生機(jī)理激活的殺菌劑產(chǎn)生協(xié)同作用。ABC運(yùn)輸器也參與植物防衛(wèi)物質(zhì)和致病因子的分泌,因此其抑制劑也可降低真菌致病性。

2.2脫毒作用增強(qiáng)和毒性代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)換作用的減弱

第2個(gè)農(nóng)藥抗性機(jī)理是由于抗性菌株中包含的酶,如細(xì)胞色素P450單氧化酶(CYP450)、水解酶和谷氨酸S-轉(zhuǎn)移酶數(shù)量增加,造成脫毒作用。在一些案例中,減弱的生物轉(zhuǎn)化能夠降低藥的激活作用。CYP450是內(nèi)源性和外源性化合物代謝過程中重要的代謝系統(tǒng)。由于許多CYP450的底物專一性較低,其中和的抗性在代謝引起的殺菌劑抗性中最為常見,第1個(gè)涉及CYP450的抗性真菌案例是水稻稻瘟病菌(P.oryzae)對(duì)硫代磷酸酯類殺菌劑的抗性?；移咸焰呔臄?shù)據(jù)表明,HydR1和HydR2表現(xiàn)型對(duì)環(huán)酰菌胺的抗性很可能與CYP450引起的羥基苯胺脫毒作用(六元環(huán)羥基化作用)的增強(qiáng)有關(guān)。灰葡萄孢菌的基因組序列和微生物分析可以對(duì)殺葡萄孢菌劑抗性涉及的CYP450異型進(jìn)行鑒別。水解酶是涉及許多種殺蟲劑抗性的一大類酶,尤其是對(duì)有機(jī)磷類。由于水解作用增強(qiáng),導(dǎo)致蘋果黑星病菌[Venturia inaequalis(Cooke)Winter]對(duì)嘧菌酯產(chǎn)生抗性,這是由于對(duì)Strobilurin類殺菌劑的天然抗性所致。一些灰葡萄孢菌田間菌株對(duì)卵綱菌殺菌劑霜脲氰敏感,并能很快代謝,很可能就是由于水解酶的作用。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一類多功能酶,可催化合成或天然親電化合物的還原性谷氨酸親核加成反應(yīng)。通常該反應(yīng)形成共軛,是重要的農(nóng)藥脫毒機(jī)制。最近從灰葡萄孢菌菌株克隆和分離的GST顯示其不具有對(duì)化學(xué)壓力耐受性的作用。破壞突變種也不降低致病力,說明GST不涉及植物防衛(wèi)系統(tǒng)的脫毒作用。谷氨酸也參與導(dǎo)致硫醇反應(yīng)物(如多位點(diǎn)殺菌劑)脫毒的非酶反應(yīng),增進(jìn)灰葡萄孢菌的谷氨酸生物合成,造成對(duì)克菌丹、百菌清的抗性。另外,谷氨酸體系也是許多生物的抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)Ellner的研究,一些二甲酰亞胺類抗性灰葡萄孢菌菌株的谷氨酸合成酶濃度上升可能就是該類藥劑產(chǎn)生抗性的機(jī)理,也可解釋二甲酰亞胺類和多位點(diǎn)殺菌劑抑菌靈產(chǎn)生交互抗性的原因。

2.3靶標(biāo)位點(diǎn)敏感性降低

對(duì)殺菌劑抗性菌株的產(chǎn)生,可以用多種真菌,包括灰葡萄孢菌對(duì)苯并咪唑類的抗性菌株說明其機(jī)理。對(duì)多數(shù)田間菌株,苯并咪唑類抗性的產(chǎn)生與β-微管蛋白基因的氨基酸密碼子198位或200位上發(fā)生等位突變有關(guān);密碼子198位上的突變也使菌株對(duì)苯基甲酸酯類的敏感性升高。對(duì)二甲酰亞胺類及其相關(guān)殺菌劑,灰葡萄孢菌所有的田間抗性菌株和實(shí)驗(yàn)室突變種的產(chǎn)生都與組胺激酶基因一個(gè)堿基對(duì)的突變有關(guān)。然而,該激酶是否就是二甲酰亞胺類的主要靶標(biāo)位點(diǎn)還需論證。分別對(duì)苯胺基嘧啶類和環(huán)酰菌胺有抗性的AniR1和HydR3菌株的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),抗性機(jī)理中包括各靶標(biāo)位點(diǎn)敏感性下降。通過對(duì)編碼齒孔醇14α-去甲基酶的灰葡萄孢菌CYP51基因的分析發(fā)現(xiàn),HydR1菌株在密碼子15位和105位上發(fā)生表達(dá)性突變,使得其對(duì)DMIs的敏感性降低。所有的灰葡萄孢菌田間菌株,包括HydR1,與其他菌類的DMIs抗性分離株一樣,在密碼子136位上有一個(gè)酪氨酸,而不是苯丙氨酸。

3結(jié)論

灰霉病是由灰霉病菌引起的世界性的重要病害,很久以來對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。由于其對(duì)各類殺菌劑均有不同程度的抗藥性發(fā)生,在田間對(duì)該病的抗性治理已成為亟待解決的問題。國外對(duì)灰霉菌抗藥性生物學(xué)及抗性機(jī)理方面的諸多研究,為灰霉病菌的科學(xué)治理及其抗性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)提供了理論依據(jù)。我國殺菌劑抗性研究起步較晚,研究水平還處于初級(jí)階段。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)灰霉病菌抗性機(jī)理方面的研究,使我國在這一領(lǐng)域盡早趕上國際先進(jìn)水平。同時(shí),對(duì)于能有效防治該病菌的藥劑應(yīng)盡量延緩菌株對(duì)其抗藥性的產(chǎn)生,延長藥劑使用壽命。加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè),合理用藥,在不同抗性發(fā)展水平地區(qū)采取相應(yīng)的綜合防治措施是解決抗性問題的有效途徑。

4參考文獻(xiàn)

[1] GULLINO AND GARIBALDI. Characterization of dicarboximide-resistant strains ofBotrytis cinerea pers.naturally ccurring in Italy[J].Meded Fae Landbouwwet Rijksuniv Gent,1982(47):781-791.

[2] PAPPAS A C,FISHER D S.Acomparison of the mechanisms of action of binclozolin procymidone,iprodione and prochlorac against Botrytis cinerea[J].Pesticide Science,1979(10):239-246.

[3] 葉鐘音,周明國,劉經(jīng)芬.植物病原菌對(duì)殺菌劑抗性的概況[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1987,10(4):56-59.

[4] 周明國,葉鐘音.植物病原菌對(duì)苯并咪唑類及相關(guān)殺菌劑的抗藥性[J].植物保護(hù),1987,18(2):31-33.

[5] 劉慧平,韓巨才,閆秀琴,等.灰霉病菌對(duì)多菌靈的抗性監(jiān)測(cè)[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,23(2):93-97.

[6] 劉波,葉鐘音,劉經(jīng)芬,等.對(duì)多菌靈、腐霉利具有重要抗性的灰霉病菌菌株性質(zhì)的研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1993,16(3):50-54.

[7] LEROUX P,LANEN C,FRITZ R. Similarities in the antifungal activities of fenpiclonil,iprodione and tolclofos-methyla gainst Botrytis cinerea and Fysariym nivale[J].Pestic Sci,1992(36):325-329.

[8] LEROUX P,CLERJEAU M.Resistance of Botrytis cinerea pers.and Pl-asmopara viticola,Berl,and de Toni to fungicides in French vineysrds[J].Crop protection,1985,4(2):137-160.

[9] LEROUX P.Recent developments in the mode of action of fungicides[J].Pestic Sci,1996(47):191-197.

[10] 韓巨才,閆秀琴,劉慧平,等.灰霉病原菌對(duì)腐霉利的抗性監(jiān)測(cè)[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,23(4):299-302.

[11] 紀(jì)兆林,童蘊(yùn)慧,張建軍,等.灰葡萄孢對(duì)腐霉利抗性的研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24(3):60-63.

[12] DEKKER T.The development of resistance to fungicide[J].Progress in Pesticide Biochemistry and Toxicology,1985(4):165-218.

[13] KATAN T,ELAD Y,YUNIS H.Resistance to diethofencarb(NPC)in benomyl-resistant field isolate of Botrytis cinerea[J].Plant Pathogy,1989(38):86-92.

[14] YARDEN O,KATAN T.Mytation lesding to substitutions at amino-acids 198 and 200 of beta-tubulin that correlated with benomyl-resistance phenotypes of field strains ofBotrytis cinerea[J].Phytopatho-logy,1993(83):1478-1483.

[15] FARETRA F,POLLASTRO S.Genetic basis of resistance to benzim-idazole and dicarboximide fungicides in Borroytinia fuckeliana(Botrytis cinerea)[J].Mycol Pes,1991(95):943-954.

[16] HILBER V W,HILBER-BODMER M. Genetic basis and monitoring of Resistance of Botrytis cinerea to anilinopyrimidines[J].Plant Dis,1998(82):496-500.

[17] 紀(jì)明山,祁之秋,趙平,等.番茄灰霉病對(duì)嘧霉胺抗藥性的試驗(yàn)[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33(5):345-347.

[18] CHAPELAND-LECLERC F,LEROUX PIERRE.Etude de la resis-tance aux anilinopyrimidines et ad,autres fongicides chez le champigno phytopathogene Botrytis ceinerea[J].PhD Thesis University Paris,2000(226):251.

[19] LEROUX P,CHAPELAND F,ARNOLD A,et al.New cases of nega-tive cross-resistance between fungicides including sterol biosynthesis inhibitors[J].Plant Patho1,2000(66):75-81.