薛金艷 王清路 竇 燁 李俏俏

摘要禽流感(AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的禽類烈性傳染病。它不僅給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,而且對人類健康和生命安全構(gòu)成了嚴重威脅。因此,禽流感已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點。從病原基因組及其編碼的蛋白質(zhì)、致病力、變異性以及對AIV的分子診斷等角度就AIV的分子生物學(xué)研究進行綜述,為防治AI提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞禽流感病毒;基因組;變異性;分子診斷;研究進展

中圖分類號 R51 文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0216-02

禽流感(Avian influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性或呼吸器官性傳染病,國際獸疫局(OIE)把該病定為A類烈性傳染病。禽流感病毒(Avian influenza vi- rus,AIV)典型的病毒粒子為球形,直徑80～120nm,有時呈絲狀體等多形態(tài),至今A型流感病毒的血凝素已發(fā)現(xiàn)有16種,神經(jīng)氨酸酶有10種。其血清型較多,容易變異。常發(fā)生在禽,有時也發(fā)生在低等哺乳類動物,至今在人僅有偶發(fā)病例。禽流感病毒根據(jù)其對雞致病性的不同分為高致病性、中致病性和低/非致病性。禽流感病毒不僅會給養(yǎng)禽、畜牧業(yè)帶來災(zāi)難性的破壞,而且對公共健康也構(gòu)成了嚴重威脅。

1AIV基因組及其編碼蛋白的功能

1.1AIV基因組

AIV基因組為單股負鏈RNA,共有8個獨立的RNA節(jié)段。通過對某些毒株8個節(jié)段的測序,發(fā)現(xiàn)它們存在一些共同的特點,即所有基因節(jié)段的5′端前13個核苷酸均相同,3′端也有12個高度保守的核苷酸,另外在每一節(jié)段靠近5′端15～21位核苷酸處有一保守區(qū)。其序列為PolyU。這一序列可以在病毒mRNA合成時產(chǎn)生PolyA。

1.2病毒的蛋白

1.2.1血凝素(Hem agglutinin,HA)。HA是流感病毒囊膜纖突的主要成分之一,是基因表達產(chǎn)物中最大的糖蛋白,為誘生保護性免疫的主要抗原,HA在病毒吸附及穿膜過程中起關(guān)鍵作用,刺激機體產(chǎn)生的中和抗體,可中和病毒的感染力,抵抗病毒的感染和發(fā)病。它是A型流感病毒毒力的主要決定因素。

1.2.2神經(jīng)氨酸酶(Heuram in idase,NA)。NA由病毒核糖核酸(vRNA)片段6編碼,是另一個主要的表面抗原,其成熟的形式是具有催化活性的四聚體,能將唾液酸從糖蛋白和糖脂中切開。其作用是水解細胞表面的特異性糖蛋白末端的N—乙?；窠?jīng)氨酸。避免病毒粒子的聚集,有利于病毒的釋放,對病毒在感染細胞周圍的擴散能力有很大影響。

1.2.3核蛋白(Nucleo protein,NP)。NP是由片段5編碼的結(jié)構(gòu)蛋白。主要功能是使病毒RNA(vRNA)形成核糖核蛋白復(fù)合體,以此來穩(wěn)定vRNA,使其免受核糖核酸作用。另外,NP在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制以及決定病毒的宿主特異性方面都有重要的作用,而且它是細胞毒性淋巴細胞識別的主要抗原。

1.2.4基質(zhì)蛋白(Matrix protein,MP)。第7節(jié)段RNA編碼的蛋白被稱為M1,部分分子量較小的蛋白稱為M2。M1構(gòu)成病毒的基質(zhì)膜,具有型特異性,其抗原性的差異也是流感病毒分型的依據(jù)之一。另外,M1在子代病毒粒子的裝配方面也有一定的作用。M2是一種跨膜蛋白,其作用是在HA合成過程中作為離子通道控制高爾基體內(nèi)的pH值,在病毒脫殼時酸化病毒粒子的內(nèi)部環(huán)境。

1.2.5聚合酶蛋白(PB1、PB2、PA)。A型流感病毒的聚合酶蛋白由PB1、PB2、PA等3種成分組成。這3種蛋白質(zhì)的共同特點是含有一特異的親核序列區(qū),其作用是使這幾種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進入細胞核。其中,PB2、PB1與合成互補RNA有關(guān),而PA、核蛋白與病毒的RNA合成有關(guān)。

1.2.6非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural proteins,NS)。A型流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白由片段8編碼。片段8也有2個編碼框,可編碼2種蛋白質(zhì)即NS1和NS2。NS1和NS2 兩種非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼區(qū)是基因組中最小的RNA片段。NS1和NS2相互間有70個氮基酸重疊,分別由不同的mRNA翻譯,提示它們由不同讀碼框架翻譯。在早期感染中NS1合成并在細胞核內(nèi)積聚,磷酸化的NS1蛋白在病毒的復(fù)制過程中起調(diào)節(jié)作用;NS2主要在晚期感染中出現(xiàn),并主要在胞漿中存在,目前它的功能還沒有徹底搞清。

1.2.7其他蛋白質(zhì)(HE、M3、NB)。由基因節(jié)段7編碼,明確的功能還不清楚。

1.3AIV毒力變異的分子基礎(chǔ)

AIV很容易發(fā)生變異,誘發(fā)AIV發(fā)生變異的主要機理有抗原性變異,即抗原漂移(Antigenic Drift)和抗原轉(zhuǎn)變(Antigenic Shift)。在甲型流感病毒中,抗原漂移主要是由HA或NA基因發(fā)生點突變引起的,其中HA基因的變異率最高。每個核苷酸在每個復(fù)制周期中的變異率可高達2.0%。一般認為,來自宿主的免疫壓力是HA和NA抗原漂移的主要原因。由于突變幅度較大或各節(jié)段RNA間發(fā)生的重排導(dǎo)致抗原性發(fā)生大轉(zhuǎn)變導(dǎo)致新病毒亞型的產(chǎn)生,這種變異稱為抗原轉(zhuǎn)變。大量試驗證明,不同亞型病毒同時感染1個細胞時,病毒基因組可發(fā)生節(jié)段間的交換。理論上講,8個RNA片段存在256個不同的組合方式。事實證明,在自然界中經(jīng)常有混合感染導(dǎo)致基因重組的事件發(fā)生。

2AIV的分子診斷

2.1血清學(xué)診斷技術(shù)

血清學(xué)診斷技術(shù)是從禽類體內(nèi)采集血液析出血清后,檢測血清中抗體的有無和滴度變化,如瓊脂凝膠擴散試驗(AGID)、細胞凝集抑制試驗(HI)。AGP試驗鑒定病毒或檢測特異性的血清抗體或基質(zhì)蛋白MP(Matrix protein)、特異性核蛋白NP。血細胞凝集試驗(HA)和血細胞凝集抑制試驗(HIT)鑒定病毒或血清抗體的亞型,神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(NI)鑒定病毒或血清抗體亞型等。

2.2RT-PCR分子診斷技術(shù)

崔尚金等(1998)建立了一種能夠直接檢測禽糞和雞胚尿囊液中H亞型禽流感病毒RNA的RT-PCR檢測方法。檢測過程僅需8h,不僅具有高度的敏感性和特異性,還可大大縮短對禽流感病毒的檢出時間。而應(yīng)用毛細管PCR(15 min,30個循環(huán))代替常規(guī)PCR(2.5h,30個循環(huán))進一步縮短檢測時間的研究也已展開。并進入更深層次的領(lǐng)域,以期用于不同樣品的檢測,使該方法更加適用于禽流感病毒的臨床早期診斷。該技術(shù)在特異地檢出H或H亞型禽流感病毒同時,還可根據(jù)應(yīng)用特定引物經(jīng)RT-PCR擴增出的H和H包括裂解位點在內(nèi)的HA基因片段。經(jīng)測序推導(dǎo)出的氨基酸序列,判斷H或H亞型禽流感病毒的致病性高低。

2.3酶免疫測定(EIA)技術(shù)

EIA技術(shù)在AI的診斷與監(jiān)測方面已被廣泛采用。Doller等建立了一種從鼻咽分泌物中直接檢測流感病毒抗原的酶免疫方法,該方法無須對病料進行超聲處理,而且在4h即可出結(jié)果。Cherian等建立了一種用于檢測呼吸道分泌物中A型流感病毒RNA的PCR酶免疫(PCREIA)方法。該方法對感染后4d的病料A型AIV的檢測特別有效。Schweiger等建立了用于檢測A型AIVN1和N2型的DNA酶免疫(DEIA)方法。該方法簡單、快速,可進行大批樣品的檢測。

2.4熒光PCR法

熒光RT-PCR技術(shù)是20世紀90年代末發(fā)展起來的新技術(shù),將熒光素標(biāo)記的探針與引物一起,在熒光PCR儀中反應(yīng),電腦對整個反應(yīng)進行實時監(jiān)測,避免了交叉污染,提高了檢測敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原體、艾滋病病毒等的檢測,根據(jù)A型禽流感病毒的共有NP基因序列設(shè)計引物、探針,建立的通用型熒光RT-PCR檢測方法不僅能夠用來檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型,而且對其他禽流感病毒亞型也能檢出。用通用型探針、引物檢測常見其他禽類病毒,未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。說明該方法敏感性高、特異性強。

2.5核酸探針技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一,是定性和定量檢測特異性DNA或RNA的有力工具。用PCR技術(shù)制備了核蛋白基因片段(NPC)的地高辛標(biāo)記cDNA探針,建立并優(yōu)化了檢測AIV的探針雜交法。該探針具有較好的特異性和敏感性,為從分子水平探討禽流感的發(fā)病機理和臨床早期快速診斷提供了新的研究手段。對以基因芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒的診斷技術(shù)進行了研究,結(jié)果表明,DNA芯片技術(shù)可以提供一種有效的AIV診斷方法。

3結(jié)論

禽流感是一種全球性的烈性傳染病,可在宿主中不斷發(fā)生變異和基因重組,是2l世紀我國養(yǎng)禽業(yè)將面臨的最大的瘟疫性威脅。禽流感可在禽、豬和人中進行傳播。AIV不僅作為人流感的最大基因庫而間接威脅人類健康,而且還可作為人類的新病毒而直接構(gòu)成人類的威脅。因此,預(yù)防禽流感具有重要的公共衛(wèi)生意義和經(jīng)濟意義。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,以及同其他學(xué)科間的滲透,禽流感的傳統(tǒng)檢測診斷技術(shù)將與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合或者現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與其他學(xué)科研究技術(shù)有機結(jié)合,一定會實現(xiàn)診斷的快捷、方便、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟、易操作,為禽流感的防治做出重大貢獻。

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