李利斌　王殿峰　劉立峰　劉國明　高建偉

摘要：運(yùn)用比較基因組學(xué)的方法，首次從大白菜基因組中鑒定出一個與擬南芥中控制種子和器官大小的基因DAl同源的序列BrDA1，并對這個基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)以及順式反應(yīng)元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明，BrDA1具有LIM家族和鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征，而且還有和泛素互作的位點(diǎn)?？赡芫哂泻虯tDA1相似的功能。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在大白菜和擬南芥DA1基因的啟動子序列中存在多個能夠響應(yīng)不同激素和逆境信號的順式反應(yīng)元件。這說明，植物DA1基因不僅與種子和器官發(fā)育有關(guān)，而且與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)存在密切關(guān)系。本文為進(jìn)一步研究DA1基因在大白菜生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中的功能以及與大白菜雜種優(yōu)勢的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜；DA1；結(jié)構(gòu)；順式反應(yīng)元件

中圖分類號：S634.1；Q343.1⁺2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942(2009)07-0001-03

植物器官大小特別是經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量部分器官的大小是影響植物產(chǎn)量的重要因素和衡量植物雜種優(yōu)勢的重要指標(biāo)，這些性狀也是受基因控制的。近年來多個控制植物器官大小的基因被克隆并得到功能驗(yàn)證，如馬鈴薯的EBP1，擬南芥中控制器官大小和發(fā)育的基因KLUH、ARF2、AP2、ANT、BB等，水稻中控制抽穗期和穗粒數(shù)的基因GDH7。影響種子大小的基因GW2、GIF1和GW5。最近，李云海等(2008)克隆了一個最終控制種子和器官大小的擬南芥基因DAl(AtDA1)。AtDA1編碼一個含有LIM結(jié)構(gòu)域的能夠和泛素相互作用的C3HCA類鋅指蛋白，負(fù)向調(diào)控種子和器官大小，該基因突變后植株的種子和器官明顯增大。因此，AtDA1類基因在種子和器官發(fā)育過程中具有重要功能，值得廣泛和深入研究。植物雜種優(yōu)勢的遺傳和分子機(jī)理研究以往多采用差異表達(dá)的方法，對雜種和親本的基因表達(dá)調(diào)控從核酸和蛋白水平進(jìn)行比較研究，找到多個在雜種和親本間顯著差異表達(dá)的基因或者蛋白，但是這些基因或者蛋白很難和植物的性狀聯(lián)系起來。本文作者認(rèn)為，直接從控制性狀的基因特別是和植物雜種優(yōu)勢表現(xiàn)密切相關(guān)的性狀的基因。如控制植物種子和器官大小的基因人手來研究植物雜種優(yōu)勢的分子機(jī)理，可能會更加富有成效。

本文利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的方法首次從大白菜基因組中鑒定出一個AtDA1的同源基因，并對這個基因的序列特征、編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和順式反應(yīng)元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為進(jìn)一步研究它在大白菜生長發(fā)育中的功能以及與大白菜雜種優(yōu)勢的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

根據(jù)擬南芥的DA1基因和蛋白序列，通過各種序列比對在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索大白菜的同源序列。利用基因組序列解析得到全長編碼區(qū)序列，并在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行手工比對和分析。根據(jù)基因組序列和編碼區(qū)序列的信息，研究基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并解析得到啟動子區(qū)序列和預(yù)測編碼的蛋白序列。然后利用PLANTCARE對啟動子序列中的順式反應(yīng)元件進(jìn)行分析，利用Pla-ntsP Feature Scan對蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測和分析。

2結(jié)果與分析

2.1大白菜DA1基因的鑒定和特征分析

利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的方法從大白菜基因組中得到一個與擬南芥DA1同源的基因，命名為BrDA1。BrDA1與AtDA1的核苷酸序列一致性高達(dá)86.73％，二者預(yù)測編碼蛋白的序列一致性為87.10％。BrDA1基因組序列長為2278bp，編碼區(qū)為1584bp，預(yù)測編碼一個含有527個氨基酸殘基、分子量為59.67ku的蛋白。這個基因位于大白菜的BAC克隆AC172888.2(47086～49363)中，含有9個外顯子，其外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2大白菜DA1基因的順式反應(yīng)元件分析

基因的表達(dá)主要是其順式作用元件和反式作用因子相互作用的結(jié)果，通過分析啟動子及其上游序列的順式反應(yīng)元件可以預(yù)測基因的功能。因此，本研究在得到BrDA1的基因組序列以后，取起始密碼子上游2000bp的序列進(jìn)行順式元件分析，結(jié)果(表1)表明。在BrDA1起始密碼子上游2000bp的范圍內(nèi)共有10種不同的順式反應(yīng)元件，包括四個脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件TATC－box和P－box各一個，一個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA，三個水楊酸響應(yīng)元件TCA，一個熱激應(yīng)答元件HSE，一個干旱響應(yīng)元件MBS，與防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的富含AT和TC的響應(yīng)元件各一個，還有兩個胚乳特異表達(dá)順式反應(yīng)元件Skn－1。另外，通過對擬南芥DA1啟動子區(qū)的分析，也發(fā)現(xiàn)了多個能響應(yīng)逆境和激素信號的順式元件(表2)，這與擬南芥DAI受ABA誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果一致。這些結(jié)果顯示，植物DA1基因可能不僅與種子和器官發(fā)育有關(guān)，而且與植物逆境響應(yīng)和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。

2.3大白菜DA1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析

為了研究大白菜DA1的功能，在解析得到它的編碼序列后，對其預(yù)測編碼的蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，BrDA1蛋白含有兩個泛素互作位點(diǎn)，一個LIM結(jié)構(gòu)域，一個zf－C3HCA結(jié)構(gòu)域，一個鋅離子結(jié)合區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域，還有8個潛在的豆蔻?；稽c(diǎn)(見表3)。這說明BrDA1蛋白具有LIM蛋白和鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征，而且可能能夠與泛素結(jié)合和被豆蔻?；?。這說明BrDA1蛋白可能具有與擬南芥DA1類似的功能，作為負(fù)調(diào)控因子來調(diào)控細(xì)胞的分裂過程，從而影響種子和器官的發(fā)育和大小。

3討論與結(jié)論

本研究利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的方法從大白菜基因組中鑒定出一個與擬南芥DA1同源的基因BrDA1，并對這個基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)以及順式反應(yīng)元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析。分析結(jié)果表明，BrDA1具有LIM家族和鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征，而且還有和泛素互作的位點(diǎn)，可能具有和AtDA1相似的功能。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在大白菜和擬南芥DA1基因的啟動子序列中存在多個能夠響應(yīng)不同激素(如脫落酸ABA和水楊酸SA)和逆境信號(如熱脅迫、干旱脅迫和病原物等)的順式反應(yīng)元件，而脫落酸和水楊酸在植物非生物逆境和抗病反應(yīng)過程中具有重要功能。這說明，植物DA1基因不僅與種子和器官發(fā)育有關(guān)，而且與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)存在密切關(guān)系。植物DA1基因?qū)Σ煌婢澈图に匦盘柕捻憫?yīng)模式、在不同組織器官和發(fā)育時期的表達(dá)情況及與植物雜種優(yōu)勢的關(guān)系值得深入細(xì)致探討。本研究為下一步研究DA1基因在大白菜生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中的功能以及與大白菜雜種優(yōu)勢的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。