夏小慧2，胡揚，李燕春

●成果報告Short Communications

ACC-β/CPT-1β基因多態(tài)性與有氧耐力的相關(guān)性研究

夏小慧1，2，胡揚3，李燕春3

目的：探討乙酰輔酶A羧化酶-β（ACC-β）和肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1β（CPT-1β）基因多態(tài)性與有氧耐力的相關(guān)性，尋找與有氧耐力表型相關(guān)的遺傳學(xué)分子標記。方法：應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜檢測技術(shù)，對123名中國北方漢族優(yōu)秀長跑運動員與127名中國北方漢族普通大學(xué)生ACC-β和CPT-1β基因區(qū)的5個SNP位點進行解析并比較分析。結(jié)果：運動員組5個SNP位點的基因型和等位基因頻率與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。ACC-β基因的rs2300455和rs2268393位點（D'=0.95，r2=0.161）存在強連鎖不平衡。CPT-1β基因的rs470117和rs131758位點（D'=0.98，r2=0.535）存在強連鎖不平衡。構(gòu)建單體型分析，未發(fā)現(xiàn)不同單體型頻率與有氧耐力表型相關(guān)聯(lián)。結(jié)論：ACC-β基因rs2075260、rs2300455和rs2268393多態(tài)位點及CPT-1β基因rs470117、rs131758多態(tài)位點與有氧耐力不相關(guān)，不能作為耐力表型的遺傳標記。

ACC-β；CPT-1β；基因多態(tài)性；有氧耐力；遺傳標記

運動能力受眾多遺傳和環(huán)境因素的影響[1-2]，其形成非常復(fù)雜。從遺傳角度來講，與多對基因有關(guān)，屬于多因子的復(fù)雜表型。近年來，大量研究通對可能影響有氧耐力的運動相關(guān)基因多態(tài)性進行研究，篩選影響表型形成的基因位點，旨在確定影響有氧耐力的遺傳學(xué)標志，為優(yōu)秀有氧耐力運動員選材提供依據(jù)。

高水平耐力運動員肌內(nèi)線粒體氧化脂肪酸的能力強，有利于運動時節(jié)省糖儲備。同時，當糖儲存耗盡時，能夠持續(xù)氧化脂肪酸提供運動肌所需能量，對提高有氧耐力十分有用。乙酰輔酶A羧化酶-β（ACC-β）和肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1β（CPT-1β）主要存在于骨骼肌和心肌，是影響運動肌中長鏈脂肪酸進入線粒體的關(guān)鍵酶，在有氧耐力運動供能過程中起重要作用。當運動引起細胞內(nèi)ATP下降時，長鏈脂肪酸進入線粒體，ACC-β的Ser218位被磷酸化[3]，并通過減弱丙二酰輔酶A（MCA）的活性調(diào)節(jié)β氧化過程中脂肪酸進入線粒體的限速酶CPT-1的作用[4-5]。

目前，尚沒有對ACC-β和CPT-1β基因多態(tài)性與運動能力相關(guān)的報道。由于ACC-β和CPT-1β基因是骨骼肌和心肌脂肪酸代謝中的關(guān)鍵酶，而脂肪酸氧化能力對有氧耐力起重要作用，我們認為這兩個基因是通過調(diào)節(jié)脂肪酸氧化而影響有氧耐力表型的微效基因，其基因多態(tài)性位點可能影響基因功能活性，從而影響有氧耐力。因此，本研究從兩個基因區(qū)選擇有代表性的多態(tài)位點，通過研究多態(tài)點在優(yōu)秀耐力運動員與普通人群中的分布不同，探討其作為影響有氧耐力遺傳標記的可能性。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

運動員組123人，年齡為（15～38）歲，其中男性56人，女性67人。運動專項為5 000m、10 000m或馬拉松跑，運動等級為健將或國際健將；普通人組127人，年齡為（18～22）歲，其中男性56人，女性67人，均無運動專業(yè)訓(xùn)練背景。所有受試者均來自山東、河北、東北3省。所有研究對象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 肘靜脈取血用W izard基因組DNA純化試劑盒（Promega）從全血中提取基因組DNA。

1.2.2 多態(tài)位點檢測根據(jù)文獻研究報道[6-8]和SNP數(shù)據(jù)庫資料，通過HapMap和Haploview軟件分析，在ACC-β基因區(qū)選取3個標簽SNP：rs2075260，rs2300455和rs2268393，在CPT-1β基因區(qū)選取了兩個標簽SNP：rs131758，rs470117。

SNP分型由Sequenom公司的MassARRAY系統(tǒng)完成。用基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF），引物延伸的方法進行多態(tài)位點解析。

用Assay Designer軟件包設(shè)計包含目的多態(tài)位點的PCR引物和單堿基延伸引物。PCR擴增目的片段，針對SNP的單堿基延伸引物進行單堿基延伸反應(yīng)。將終止反應(yīng)物脫鹽后點樣到spectroCHIP上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行分析。最終結(jié)果由MassARRAY RT軟件系統(tǒng)（版本號3．0．0．4）實時讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)（版本號3．4）完成基因分型分析。

PCR反應(yīng)體系為：DNA樣本：1μL（5 ng/μL）；PCR引物：1 μL；dNTP：1μL（2．5 mM）；MgCl2：0．325μL（25 mM）；HotStar Taq酶：0．1μL；PCR緩沖液：0．625μL；H2O：0．95μL。PCR反應(yīng)條件：94℃15 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1 min，共45個循環(huán)；最后72℃3m in。

單堿基延伸反應(yīng)體系為：H2O：0．755μL；10×iPLEX緩沖液：0．2μL；終止混合物：0．2μL、iPLEX酶：0．041μL，延伸引物：0．804 uL（10μM）。單堿基延伸反應(yīng)條件：94°C 30 s；94℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，共40個循環(huán)；最后72℃3m in。

表2 運動員組和對照組等位基因和基因型分布比較Table 2 Distribution and analysis ofallele and genotype frequency in athlete and controlgroup

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析由shesis在線軟件[9]完成。對每個位點進行等位基因頻率、基因型頻率統(tǒng)計，并對運動員組和對照組進行哈溫平衡檢測。對運動員組和對照組的等位基因和基因型頻率進行卡方檢測。不同位點進行兩兩的D'和r2計算，度量位點間連鎖不平衡緊密程度。位于強連鎖不平衡區(qū)的位點進行單倍型頻率分析。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各位點完成檢測樣本數(shù)

對照組和運動員組各位點完成檢測樣本量見表1。

表1 各位點完成檢測樣本量Tab le 1 Sam p le num bers ofeach site

2.2 單個SNP位點與有氧耐力相關(guān)性

運動員組和對照組所有位點的等位基因和基因型頻率均符合哈溫平衡（見表2）?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示，各位點運動員組和普通人組基因型和等位基因頻率之間均無顯著性差異（P＞0．05）。將運動員組按不同運動項目進行分組，分為馬拉松項目組和5 000m/10 000m項目組，與對照組相比，各組間基因型和等位基因頻率亦無顯著性差異（P＞0．05，數(shù)據(jù)略）。

2.3 連鎖不平衡和單體型分析

對不同位點進行兩兩的D'和r2計算結(jié)果顯示，ACC-β基因的rs2300455和rs2268393位于強連鎖不平衡狀態(tài)（D'=0．95， r2=0．161），CPT-1β基因的rs470117和rs131758位點位于強連鎖不平衡狀態(tài)（D'=0．98，r2=0．535），而ACC-β基因的rs2075260與其他位點不處于連鎖不平衡狀態(tài)（D'＜0．33或/和r2＜0．1）[10]。ACC-β基因和CPT-1β基因內(nèi)部處于強連鎖不平衡的多態(tài)位點分別形成了3個單體型（所有頻率小于0．03的基因型都被忽略)。經(jīng)卡方檢驗，運動員組和對照組的單體型頻率都沒有顯著性差異。同樣，對照組與不同水平運動員組（分為馬拉松項目組和5 000m/10 000m項目組）比較，也沒有發(fā)現(xiàn)單體型頻率與有氧耐力之間的相關(guān)性（P＞0．05，數(shù)據(jù)略）。

3 討論

本研究首次探討ACC-β和CPT-1β基因區(qū)SNP與有氧耐力之間可能的關(guān)聯(lián)性。ACC-β和CPT-1β定位于與肥胖相關(guān)的基因區(qū)[11]。ACC-β基因區(qū)的rs2268393和rs2268391多態(tài)性與荷蘭人的II型糖尿病相關(guān)，而其中rs2268393多態(tài)性與中國北方漢族人的II型糖尿病相關(guān)聯(lián)[7]。在Julie的研究中，選擇了CPT-1β基因區(qū)的9個多態(tài)位點，研究其與肥胖的相關(guān)性。結(jié)果顯示rs131579和rs4701117位點多態(tài)性與肥胖顯著相關(guān)[8]。另有研究從CPT-1β基因選擇了3個多態(tài)位點，研究其與左心室指數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性[9]。這些研究結(jié)果顯示，ACC-β和CPT-1β基因區(qū)域的位點多態(tài)性與能量代謝表型相關(guān)聯(lián)。

經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析，ACC-β位于染色體12q24．11。本研究選擇的3個標簽SNP分別位于外顯子11（rs2300455，Ala/ Thr)，外顯子46（rs2075260，Val/IIe)以及內(nèi)含子16（rs2268393，C/T)，并在北方漢族人群中有較高雜合度。Rs2300455和rs2075260位點多態(tài)性引起所編碼氨基酸的改變，從而可能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。用DNAstar軟件中Chou-Fasman方案預(yù)測，當rs2300455編碼的氨基酸由Ala→Thr時，其二級結(jié)構(gòu)中一個由12個氨基酸形成的β折疊結(jié)構(gòu)被破壞，形成了一個由8個氨基酸形成的α-螺旋和一個由5個氨基酸形成的β折疊。rs2075260編碼的氨基酸由Val→IIe時，該蛋白質(zhì)的親水性發(fā)生了變化，用K-D標準預(yù)測，親水值從0.467上升到0.5。用NNSPLICE軟件預(yù)測位于16號內(nèi)含子處的rs2268393（C/T)位點的可能意義，結(jié)果顯示當C→T時，該內(nèi)含子區(qū)一個可變剪切位點值從0.74降為0.67。以上預(yù)測結(jié)果表明，這3個位點的多態(tài)性在一定程度上改變了相應(yīng)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，有可能進一步影響蛋白質(zhì)的功能。

CPT-1β位于染色體22q13.33，研究報道染色體上該區(qū)域與運動相關(guān)能力表型有關(guān)。rs131758（5'UTR，A/T)和rs470117（3'UTR，A/G)位于基因調(diào)節(jié)區(qū)，可能通過影響啟動子活性或者結(jié)合于miRNA而影響mRNA穩(wěn)定性來影響基因的表達。

然而，本研究結(jié)果顯示，所選的ACC-β和CPT-1β基因區(qū)的5個標簽SNP多態(tài)性與有氧耐力無關(guān)?？赡艿脑蛉缦?有氧耐力表型受多種遺傳因素影響，其中生理因素主要指氧的供應(yīng)和能量的供應(yīng)兩個方面。具體包括肺的通氣功能、血液的載氧能力、心臟的射血能力、骨骼肌的有氧代謝能力以及能量物質(zhì)的供應(yīng)能力。每個因素對表型的影響都是重要的，但是對其影響程度無法量化。因此，脂肪酸氧化提高糖儲備以及在長時間運動后期作為主要的能量物質(zhì)氧化供能，可能是影響有氧耐力的因素之一，但ACC-β和CPT-1β基因的多態(tài)位點對有氧耐力表型影響的程度可能較弱。同時，有氧耐力的形成除了受微效基因的影響外，又受環(huán)境的影響，而環(huán)境因素的影響又是非常復(fù)雜，包括社會環(huán)境、自然環(huán)境等。

4 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，ACC-β和CPT-1β基因是影響有氧耐力的微效基因，其基因區(qū)5個標簽SNP多態(tài)性與有氧耐力表型的不相關(guān)，不能作為有氧耐力的遺傳標記。

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Association Between ACC-β/CPT-1βPolymorphismsand Aerobic Endurance

XIA Xiaohui1，2，HU Yang3，LIYanchun3
（1．School of PE，Lanzhou City University，Lanzhou 730070，China；2．Graduate School，Beijing Sport University，Beijing 100084，China；3．Sports Research Center，Beijing Sport University，Beijing 100084，China）

Objective：Determiningwhether single nucleotide polymorphisms（SNPs）in the ACC-β/CPT-1βgenes region contribute to endurance exercise capacity and searching for genetic marks associated for aerobic endurance performance．Methods：Five SNPs in ACC-βand CPT-1βgene regionswere selected．The genotypes of the 123 elite long running athletes in the north of China and 127 college students in the north of China as controls were analyzed using thematrix assisted laser desorption ionisation-time of flightmass spectrometrymethod（MALDI-TOF）．Results：No differences were shown in allele and genotype frequenciesbetween the controls and the athletes（P＞0．05）．Rs2300455，rs2268393（D’=0．95，r2=0．161）were in a strong linkage disequilibrium block of ACC-βgene and rs470117，rs131758（D’=0．98，r2=0．535）in CPT-1βgene．No haplotypes of ACC-βand CPT-1βwere associated with endurance exercise capacity．Conclusion：Lack of association of ACC-β/CPT-1βpolymorphisms or haplotypes with Chinese elite endurance athletes and the selected SNPs failed to be a geneticmark of aerobic endurance performance．

ACC-β；CPT-1β；polymorphisms；aerobic endurance performance；geneticmark

G 804．23

A

1005-0000（2010）05-0373-02

2010-06-09；

2010-08-05；錄用日期：2010-08-10

國家科技攻關(guān)計劃項目（項目編號：2003BA904B04）

夏小慧（1973-），女，甘肅臨洮人，講師，北京體育大學(xué)在讀博士研究生，研究方向為運動分子生物學(xué)。通訊作者：胡揚（1958-），男，江蘇人，北京體育大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。

1.蘭州城市學(xué)院體育學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.北京體育大學(xué)研究生院，北京100084；3.北京體育大學(xué)科研中心，北京100084。