纖維原料酶水解的研究進展

田野 李旺 劉順明 劉鵬 楊秀麗（山東輕工業(yè)學院，山東濟南，50353；山東壽光濰坊科技學院，壽光，6700）

纖維原料酶水解的研究進展

田野1李旺2劉順明1劉鵬1楊秀麗1
（1山東輕工業(yè)學院，山東濟南，250353；2山東壽光濰坊科技學院，壽光，262700）

木質纖維原料酶水解是利用木質纖維原料生產燃料酒精的關鍵步驟之一。對纖維素酶及其水解木質纖維原料作用機制、纖維素酶的生產、木質纖維原料酶水解的影響因素和木質纖維原料酶水解動力學作了全面綜述,并對提高木質纖維原料酶水解效率和降低水解成本的途徑進行了討論。

木質纖維原料 纖維素酶 酶水解

以木質纖維為原料生產燃料酒精是解決人類所面臨能源和環(huán)境問題,保持社會可持續(xù)發(fā)展的一條有效途經。木質纖維原料水解是利用木質纖維原料生產燃料酒精的關鍵步驟之一[1]。人們對木質纖維原料水解已進行了大量的研究工作,早在1819年人們便開始采用濃酸對木質纖維原料水解的研究[2],1888年開始采用稀酸對木質纖維原料水解的研究[3],并于1898年建成第一套木質纖維原料酸水解的工業(yè)化裝置[2]。在20世紀30～40年代人們對木質纖維酸水解然后發(fā)酵生產酒精進行了大量的研究工作,在木質纖維酸水解工藝方面進行了不少改進,開發(fā)成功高溫稀酸木質纖維酸水解的Scholler&Madison工藝,以木質纖維為原料生產酒精得到了較大的發(fā)展[2]。但由于強酸對設備的腐蝕,對環(huán)境所造成污染及強酸回收利用等方面得不到好的解決,因此,以后木質纖維原料酸水解一直沒有大的發(fā)展。而木質纖維的酶水解具有反應條件溫和,對設備基本無腐蝕,環(huán)境友好,水解產物對于發(fā)酵生產酒精抑制作用較弱,而得到較快的發(fā)展。木質纖維的酶水解在整個由木質纖維原料生產燃料酒精成本中占60%左右 ,控制木質纖維的酶水解的成本,在由木質纖維原料生產燃料酒精工業(yè)化過程中,起著非常重要的作用。本文作者對纖維素酶及其水解木質纖維原料作用機制、纖維素酶的生產、木質纖維原料酶水解的影響因素、木質纖維原料酶水解動力學及提高木質纖維酶水解效率和降低水解成本的途徑加以分析。

1 纖維素酶及其水解木質纖維原料作用機制

纖維素酶是降解纖維素原料生成葡萄糖的一組酶的總稱,它不是單種酶,而是起協(xié)同作用的多組分酶系[3]。自1906年Seilliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來,人們對纖維素酶的組成、結構和水解作用機制已做過大量研究。對于一個完整的纖維素酶系而言,它至少包括3類性質不同的酶。

1.1 C1酶

C1酶是纖維素酶系中的重要組分,它在天然纖維素的降解過程中起主導作用。但是對它在纖維素水解過程中的作用有不同的看法。Reese等認為C1酶的作用是將結晶性纖維素變成非結晶性纖維素,而Wood和Mccrae則認為C1酶實際上是一種水解酶,其作用是將結晶性纖維素水解為纖維二糖。

1.2 Cx酶

Cx酶又稱之為β-1,4-葡聚糖酶,是一種水解酶,它不能作用結晶性纖維素,主要作用是水解非結晶性纖維素。它有兩種不同的類型:外切β-1,4-葡聚糖酶和內切β-1,4-葡聚糖酶。外切β-1,4-葡聚糖酶能從纖維素鏈的非還原性末端一個一個地依次切下葡萄糖單位,產物是葡萄糖,其專一性比較強。同時它對纖維寡糖的親合力強,能迅速水解內切β-1,4-葡聚糖酶作用纖維素產生的纖維寡糖為葡萄糖。內切β-1,4-葡聚糖酶以隨機形式水解非結晶性纖維素,它作用于較長的纖維素鏈,對末端的敏感性小,水解主要產物是纖維糊精,纖維三糖和纖維二糖。

1.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶又稱之為纖維二糖酶,其作用是內切β-1,4-葡聚糖酶水解非結晶性纖維素得到的產物是纖維糊精,纖維三糖和纖維二糖水解為葡萄糖。該酶的專一性比較差。對于同一類性質的酶,其分子結構并不相同。但一般來講,纖維素酶都應包含結合區(qū)和催化區(qū)兩部分。由不同的微生物所合成的纖維素酶的組成不同,結構不同,對于纖維素具不同的分解能力。目前,對于纖維素酶水解纖維素的作用機制有多種假說,大家普遍認可的是Reese等提出的C1-Cx假說,如圖1所示。但對于C1-Cx假說來說,存在兩個方面的問題:一個是到目前為止,沒有分離出將結晶性纖維素變成非結晶性纖維素的C1酶,另一個是C1酶如何將結晶性纖維素變成非結晶性纖維素。對于纖維素酶水解纖維素的作用機制另一普遍認可的事實是構成纖維素酶的各組分間存在協(xié)同作用[4]。

圖1 纖維素酶水解纖維素的C1-Cx作用機制模型

2 纖維素酶的生產

自然界很多微生物具有產生纖維素酶降解木質纖維的能力,包括真菌、細菌及部分放線菌。文獻報道的真菌有:Trichoderm a reesei,Trichoderm akoningii,Trichoderm a lignorum,Aspergillus n iger,Asperg illus f lavus,Aspergillus oryzae,S ch izophy llumcomm une,Penicillium citrinum,Penicillium nota 2tum,Sclerotium rolfsii等[14-15,17,22-23]。 文獻報道的細菌有:Cellulom onas f im i,Clostridium longispo2 rum,B acillus lautus,Therm om onospora fusca,Clos2tridium therm ocellum,B acteroides cellulosolvens等 。盡管文獻報道有超過200種微生物具有產生纖維素酶的能力,但研究最多并用于工業(yè)生產的主要是Trichoderm a屬的真菌,特別是Trichoderm a reesei。工業(yè)生產纖維素酶可以采用深層液體發(fā)酵,也可采用固體發(fā)酵,目前工業(yè)生產纖維素酶仍以固體發(fā)酵為主[5]。盡管固體發(fā)酵設備簡單,投資少,但發(fā)酵水平不穩(wěn)定,生產效率低,易染雜菌,工人勞動強度大,不適合大規(guī)模工業(yè)化生產。深層液體發(fā)酵生產纖維素酶是以后的發(fā)展方向 。目前,纖維素酶水解木質纖維原料生產燃料酒精成本高,來自于纖維素酶生產主要原因表現(xiàn)在兩個方面,一方面是纖維素酶的水解效率低(相比于淀粉酶),這在很大程度上是由于纖維素酶是一個起協(xié)同作用的多組分酶系,各個組分之間配合不協(xié)調所致。目前應用最多的李氏木酶就存在這個問題,解決這個問題方法之一就是通過基因工程的方法將黑曲酶的纖維二糖酶基因轉入李氏木酶,并得到表達 。另一方面是纖維素酶的生產成本高,這可以通過改良菌種,優(yōu)化培養(yǎng)條件和降低培養(yǎng)基成本而逐步得到解決。另外一個令人們很感興趣可能會大幅降低纖維素酶生產成本的方法是通過基因工程的方法將纖維素酶基因轉入植物并得到高效表達[6]。Sun將源自A.celluloly ticus的內切β-1,4-葡聚糖酶轉入一種稱為浮萍的植物并得到表達,內切β-1,4-葡聚糖酶占浮萍中可溶性蛋白的0.27%。Ziegelhoffer等將源自Therm om onospora fusca的內切β-1,4-葡聚糖酶與纖維二糖酶轉入煙草,內切β-1,4-葡聚糖酶與纖維二糖酶分別占煙草可溶性蛋白的0.1%和0.02%。Hooker等將源自A.cellulolyticus的內切β-1,4-葡聚糖酶轉入煙草和土豆,內切β-1,4-葡聚糖酶分別占煙草和土豆可溶性蛋白的1.35%和2.6%。Ziegler等將源自A.cellulolyticus的內切β-1,4-葡聚糖酶轉入一種稱為A.thaliana的植物,內切β-1,4-葡聚糖酶占其葉子的可溶性蛋白的26%。由此可見,轉基因植物確實可能成為廉價生產纖維素酶的一種方法。

3 木質纖維原料酶水解的影響因素

影響木質纖維原料酶水解的因素主要包括:底物、纖維素酶和水解條件。底物(經預處理的木質纖維原料)通過兩個方面影響其酶水解速率和可發(fā)酵糖的得率,一方面是底物的性質,它包括預處理后的木質纖維原料的可及度、纖維素的結晶度、木質素和半纖維素的含量及其與纖維素的結合方式[7],同時也包括預處理后的木質纖維原料是否含有酶水解的抑制物,抑制物的種類和數量,這就說明選擇合適的預處理方法對木質纖維原料酶水解至關重要,如Vlasenko曾對采用不同的預處理方法對稻草水解進行過對比研究。另一方面是底物的濃度,底物濃度過高對木質纖維原料酶水解有抑制作用,會使木質纖維原料酶水解速率變慢,可發(fā)酵糖的得率降低,但如果底物濃度過低,木質纖維原料酶水解速率慢,所得可發(fā)酵糖濃度低而無工業(yè)應用價值,因此木質纖維原料酶水解有一個最佳底物濃度。纖維素酶是影響木質纖維原料酶水解成本與水解效率的另一關鍵因素,由于不同的微生物會產生不同酶系的纖維素酶,對不同的木質纖維原料有不同的水解能力,因此根據底物的性質選用合適的纖維素酶至關重要,在必要時需采用來源于不同微生物纖維素酶復配而成的復合酶制劑;另外酶的用量對木質纖維原料酶水解的成本與經濟的可行性有決定性的作用,因此合適的酶濃度是木質纖維原料酶水解所必需的。木質纖維酶水解條件包括酶水解溫度、pH值、底物濃度、酶用量和水解時間,它們在酶水解過程中的重要性很早就受到人們的重視,人們已通過多種方法對木質纖維酶的水解條件進行了優(yōu)化[8]。

4 木質纖維原料酶水解動力

木質纖維原料酶水解的動力學研究對于弄清木質纖維原料酶水解的過程機制、工程放大和過程控制都具有重要意義,因此人們對于木質纖維原料酶水解的動力學已進行了大量的研究工作[9]。但是由于木質纖維原料酶水解過程的復雜性,包括底物的組成與結構的多樣性、纖維素酶來源及成分的多樣性和在酶水解過程中底物的反應能力的變化及纖維素酶活性的變化,使得各個研究者所得出酶水解的動力學表達式及模型參數值差異較大,對于描述木質纖維原料酶水解過程不具有普遍意義。不過,在木質纖維原料酶水解的動力學研究方面下面兩點認識是一致的。一是木質纖維原料酶水解是一個非均相反應,纖維素酶首先要擴散到底物的表面,在底物的表面被吸附,然后反應將纖維素水解為可發(fā)糖,纖維素酶在經過解吸和擴散進入溶液主體,生成的可發(fā)酵糖也經過擴散進入溶液主體。另外一點是木質纖維原料酶水解會受到底物和水解產物 (纖維二糖和葡萄糖)的抑制,在同步糖化發(fā)酵生產酒精時還會受到發(fā)酵產物酒精的抑制,如圖2所示:

圖2 木質纖維同步糖化發(fā)酵生產酒精的調控機制示意圖

結論

提高木質纖維原料酶水解效率與降低水解成本一直是人們研究由木質纖維原料生產燃料酒精的重點。人們對此已進行過大量的研究,主要有以下幾種措施:

1)選高產纖維素酶生產菌株,或是采用基因工程方法構建高產纖維素酶基因工程菌,選取合適的發(fā)酵方法與后提取工藝,以降低纖維素酶的生產成本[10]。同時,利用轉基因植物生產纖維素酶也可能是大幅降低纖維素酶的生產成本的一種方法。

2)對纖維素酶生產菌株采用基因工程方法進行改良,使其產生的纖維素酶各個組分配合更加協(xié)調,構成一個高效的纖維素酶系,以提高木質纖維原料的酶水解效率[11]。

3)在對木質纖維原料進行預處理的時侯,應最大限度地增加木質纖維原料的可及度、降低其纖維素的結晶度、除去其中的木質素和半纖維素 ,但應盡量避免木質纖維原料酶解的抑制物的生成[12]。

4)在木質纖維原料酶水解過程中加入非離子表面活性劑,減少纖維素酶與纖維素之間的不可逆結合和纖維素酶與木質素之間的非選擇性吸附,從而提高木質纖維原料的酶水解效率。

5)在酶水解過程中采用酶復合制劑,使各種不同性質的酶更好地協(xié)同作用,減小纖維二糖、產物還原糖和半纖維素水解產物對酶水解過程抑制作用,如在Trichoderm a reesei所產生的纖維素酶中加入纖維二糖酶就能有效地加快木質纖維原料的酶水解[13]。

6)對纖維素酶進行固定化,以便纖維素酶的重復使用,從而降低木質纖維原料的酶水解的成本。另有報道通過膜分離的方法可以有效的回收纖維素酶,降低木質纖維原料的酶水解的成本[14]。

7)為了有效地消除產物抑制,將水解可發(fā)酵糖從酶水解系統(tǒng)通過超濾移出,或是采用同步糖化發(fā)酵及時將生成的可發(fā)酵糖消耗掉[15]。

8)用同步產酶與糖化工藝,將纖維素酶的合成與木質纖維原料的酶水解耦合在同一裝置內進行,這樣即可以減化工藝,同時又可以減少設備投資[16]。

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2010－8－11

田野（1982.10.2） .

山東輕工業(yè)學院在讀研究生

研究方向:制漿造紙綠色化學與技術

E-mail:tianye861080@163.com

電話:15254117641

通訊地址:山東濟南西部長清大學城,山東輕工業(yè)學院制漿造紙08級研究生

環(huán)境保護