劉秋霞 蔡嬌陽(yáng) 李本尚 湯靜燕

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)是起源于神經(jīng)嵴的兒童外周神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占兒童實(shí)體瘤的8%～10%。隨著化療方案的改進(jìn)及綜合治療的開展，許多兒童腫瘤的預(yù)后明顯改善，但NB患兒的預(yù)后沒有顯著提高，特別是晚期患兒的轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率較高，長(zhǎng)期生存率不到40%[1]。腫瘤干細(xì)胞(TSC)假說(shuō)認(rèn)為，腫瘤組織中存在一群與干細(xì)胞有相似特性的細(xì)胞，稱為TSC[2]；這群細(xì)胞具有無(wú)限增殖和多向分化的能力，決定了腫瘤的發(fā)生和演變。TSC與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥都有密切的聯(lián)系。可以推測(cè)晚期NB患兒中的TSC是其預(yù)后較差的原因之一。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，正常神經(jīng)干細(xì)胞在添加生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中，能分裂增殖為多細(xì)胞克隆球，形成三維球狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)球，此神經(jīng)球中富集干細(xì)胞和祖細(xì)胞[3]。Hansford等[4]報(bào)道無(wú)血清培養(yǎng)原代NB細(xì)胞形成的神經(jīng)球具有干細(xì)胞特性，10個(gè)成球細(xì)胞就可以使非肥胖型糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺損(NOD/SCID)小鼠成瘤。本研究通過(guò)體外觀察和鑒定13-順維甲酸對(duì)NB干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，為臨床應(yīng)用13-順維甲酸治療NB微小殘留病灶提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 方法

1.1 材料 DMEM /F12培養(yǎng)基、B27和0.25%胰酶購(gòu)于GIBCO公司；人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和人堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司；Ex-TaqPCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；Poly-D-Lysine和13-順維甲酸購(gòu)于Sigma公司；鼠抗人nestin 單克隆抗體購(gòu)于ABcam公司；Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自Jackson Immunoresearch Laboratories公司。

1.2 神經(jīng)球的培養(yǎng)、分離純化及誘導(dǎo)分化 共收集到14例伴骨髓轉(zhuǎn)移(骨髓涂片可見成團(tuán)的腫瘤細(xì)胞，流式分析CD56+CD81+CD45-的細(xì)胞為NB細(xì)胞)的Ⅳ期NB患兒的骨髓液標(biāo)本，各取骨髓液3 mL，用Ficoll分離液分離出的單個(gè)核細(xì)胞置入25 cm2培養(yǎng)瓶中，重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基，含20 μmol·L-1EGF、20 μmol·L-1bFGF和2%B27)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105·mL-1，于37℃、5%CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)。每3 d向培養(yǎng)瓶中滴加新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，采用機(jī)械法輕輕打散細(xì)胞，每7 d按1∶3比例傳代1次。

為了解最適合的13-順維甲酸濃度和分化時(shí)間，本研究以不同濃度13-順維甲酸和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)述如下：6孔板中分別添加0.1 、0.5、1、5、10和20 μmol·L-1的13-順維甲酸，分別在0、3、6、9、12 和15 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)含10 及20 μmol·L-113-順維甲酸的細(xì)胞很快死亡，而0.1、0.5、1和5 μmol·L-113-順維甲酸的細(xì)胞隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，漸分化，以5 μmol·L-1最顯著，含5 μmol·L-113-順維甲酸的細(xì)胞誘導(dǎo)至9 d后，細(xì)胞顆粒逐漸增多，12～15 d細(xì)胞逐漸死亡。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇5 μmol·L-113-順維甲酸，以3及9 d作為誘導(dǎo)分化觀察時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究。

用400目的篩網(wǎng)輕輕過(guò)濾含有神經(jīng)球的培養(yǎng)液，收集未濾過(guò)篩網(wǎng)的神經(jīng)球，機(jī)械法打散神經(jīng)球細(xì)胞后，在含10%FBS的DMEM/F12血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后，次日添加5 μmol·L-113-順維甲酸(DEMO溶解，DEMO終濃度<1‰)，每3 d胰酶消化和傳代，并添加5 μmol·L-113-順維甲酸。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)神經(jīng)球細(xì)胞Oct-4的表達(dá) Trizol法分別提取未經(jīng)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)3和9 d的3組NB神經(jīng)球細(xì)胞的總RNA。RNA經(jīng)濃度測(cè)定和電泳質(zhì)檢后，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。然后，PCR檢測(cè)干細(xì)胞特異表達(dá)基因Oct-4表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。

目的基因Oct-4的引物序列為：

正向 5′-GACAACAATGAAAATCTTCAGGAGA-3′；

反向5′-TTCTGGCGCCGGTTACAGAACCA-3′；

片段長(zhǎng)度為218 bp。

內(nèi)參GAPDH的引物序列為：

正向5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′；

反向5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′；

片段長(zhǎng)度為99 bp。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中模板cDNA 1 μL；Ex Taq 酶0.125 μL；10×Ex Taq buffer 2 μL；dNTP mixture 2 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μL。將PCR管放入Eppendorf PCR儀，設(shè)定反應(yīng)條件：94℃ 5 min；然后94℃ 30 s，退火溫度 30 s，72℃ 30 s循環(huán)，Oct-4、GAPDH的退火溫度分別為50℃和56℃，Oct-4循環(huán)30次，GAPDH循環(huán)25次；最后72℃延長(zhǎng)2 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，比較誘導(dǎo)后神經(jīng)球細(xì)胞Oct-4的表達(dá)變化。

1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)前后巢蛋白(nestin)的表達(dá)變化 將未經(jīng)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)球細(xì)胞和5 μmol·L-113-順維甲酸誘導(dǎo)9 d的細(xì)胞，置入1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，濃度調(diào)整為1×105·mL-1，將Poly-D-Lysine處理過(guò)的無(wú)菌蓋玻片放入24孔板，分別滴加兩組細(xì)胞各2 mL，8 h后細(xì)胞貼壁，無(wú)菌鑷子取出蓋玻片。

將蓋玻片分別用冰冷的3.7%的多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后用含0.1%Triton X-100的PBS溶液破膜30 min；5%BSA室溫封閉1 h，加nestin一抗(1∶200)，室溫孵育2 h；然后用PBS洗滌5次，每次5 min；室溫下再次用5%BSA封閉1 h，隨后加入Cy3標(biāo)記二抗(1∶2 000)，室溫避光結(jié)合30 min；最后，DAPI(1∶1 000)避光染核10 min。PBS清洗3次，每次5 min。待蓋玻片自然干燥后，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。設(shè)不加一抗組作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 NB神經(jīng)球的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 14例骨髓液標(biāo)本中，4例分離到原代NB細(xì)胞，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6 d后，可見懸浮神經(jīng)球形成，傳代后，成球細(xì)胞能再次分裂增殖為神經(jīng)球，其中2例連續(xù)穩(wěn)定傳代(骨髓中腫瘤細(xì)胞>90%)，另外2例在不斷傳代中逐漸貼壁、分化。

神經(jīng)球細(xì)胞在血清培養(yǎng)基中開始貼壁生長(zhǎng)，呈三角形或星形，細(xì)胞突起鈍且短(圖1A)；添加5 μmol·L-113-順維甲酸誘導(dǎo)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度降低，形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞突起增多和變長(zhǎng)，逐漸連接成網(wǎng)(圖1B～D)。

圖1 NB神經(jīng)球的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

Fig 1 The culture and differentiation of neurosphere cells

Notes A：Neuroblastoma cells from bone marrow aspirates formed nonadherent spheres after growing in serum-free stem cell conditions for 4-6 days；B,C,D：The morphology of neurosphere cells before induction, 3 days and 9 days after induction respectively. Neurosphere cells were cultured in differentiation medium supplemented with 5 μmol·L-113-cis-retinoic acid. The cells attached to the bottom of the culture dish and protruded cell processes. Most of the cells gained a neuronal morphology and the processes grew much more and longer, then reached into a network

2.2 RT-PCR法檢測(cè)NB神經(jīng)球Oct-4的表達(dá)及13-順維甲酸誘導(dǎo)后表達(dá)的改變 RT-PCR法檢測(cè)到未分化的NB神經(jīng)球細(xì)胞表達(dá)Oct-4，13-順維甲酸誘導(dǎo)3 d后，其表達(dá)降低，誘導(dǎo)9 d后Oct-4表達(dá)消失(圖2)。

圖2 RT-PCR法檢測(cè)13-順維甲酸誘導(dǎo)后NB神經(jīng)球細(xì)胞Oct-4的表達(dá)

Fig 2 Oct-4 expression of neurosphere cells during the induction detected by RT-PCR

Notes Lane 1 to 3: showing the corresponding GAPDH expression as control;Lane 4 to 6: denoting Oct-4 gene expression of neurosphere cells before induction, 3 and 9 days after induction respectively, the expression level of Oct-4 was decreased with the duration of using 13-cis-retinoic acid increased

2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NB神經(jīng)球13-順維甲酸誘導(dǎo)后nestin的表達(dá) 未經(jīng)13-順維甲酸誘導(dǎo)的NB神經(jīng)球細(xì)胞表達(dá)nestin(圖3A)，提示神經(jīng)球細(xì)胞中含有TSC，13-順維甲酸誘導(dǎo)9 d后，nestin的表達(dá)已經(jīng)明顯減弱(圖3B)，提示TSC已經(jīng)分化。

圖3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)13-順維甲酸誘導(dǎo)后NB神經(jīng)球細(xì)胞nestin的表達(dá)

Fig 3 Nestin expression of neurosphere cells during the induction detected by cell immunofluorescence

Notes A：Neurosphere cells were positive for nestin before induction；B：Induced by 13-cis-retinoic acid for 9 days neurosphere cells expressed less nestin

3 討論

隨著TSC假說(shuō)得到越來(lái)越多證據(jù)的證實(shí)，腫瘤的治療理念也發(fā)生了改變，真正有效的治療可以針對(duì)TSC。傳統(tǒng)的放、化療治療惡性腫瘤主要針對(duì)腫瘤中的快速增殖細(xì)胞，而不是TSC。雖然短期內(nèi)腫瘤快速縮小，但遠(yuǎn)期療效不佳，復(fù)發(fā)率較高。原因首先是TSC處于相對(duì)靜止期，偶爾進(jìn)入細(xì)胞周期；再者，TSC表達(dá)ABCG2、抗凋亡蛋白，具有增強(qiáng)的DNA修復(fù)能力[5]，比成熟分化細(xì)胞更有耐藥性。TSC的治療方法除了通過(guò)依賴TSC表面抗原及信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子來(lái)抑制或消除TSC外，另一個(gè)有效方法是誘導(dǎo)TSC分化。

高危NB患兒經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)化療和清髓性鞏固治療后，大部分還會(huì)復(fù)發(fā)，提示清髓性鞏固治療后很可能還存在含有TSC的微小殘留病灶。許多誘導(dǎo)劑如維甲酸、AMP和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等均能誘導(dǎo)人NB細(xì)胞株的軸突生長(zhǎng)[6]，其中維甲酸主要作用于RAR和RXR兩種受體，是最有潛力的NB微小殘留病灶的誘導(dǎo)劑，能誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞分化，同時(shí)伴有腫瘤細(xì)胞增殖減低[7]。CCG(Children Cancer Group，兒童腫瘤協(xié)作組)的一項(xiàng)RCT研究顯示，接受移植后給予13-順維甲酸治療的患兒無(wú)事件生存率顯著提高[(46%±6%)vs(29%±6%)，P=0.027]， 對(duì)骨髓移植后存在微小殘留病灶的患兒有治療效果[8]。其他的維甲酸，如9-順維甲酸、全反式維甲酸和芬維A胺對(duì)高危NB患兒的微小殘留病灶也具有活性。

Oct-4的表達(dá)只限于多能干細(xì)胞，隨著分化的啟動(dòng)及多能性的喪失，其表達(dá)水平逐漸降低[9，10]。Nestin是一種中等纖維蛋白，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子[11]。本研究用無(wú)血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)NB細(xì)胞，形成富集TSC的懸浮神經(jīng)球，證實(shí)13-順維甲酸能誘導(dǎo)神經(jīng)球細(xì)胞分化，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，干細(xì)胞基因Oct-4和神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記nestin的表達(dá)逐漸降低，提示13-順維甲酸能有效誘導(dǎo)分化TSC，為臨床將維甲酸用于NB的維持治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

維甲酸能誘導(dǎo)細(xì)胞分化已得到了大量實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，本研究從TSC角度論證了13-順維甲酸是有效的TSC誘導(dǎo)劑，為研究維甲酸治療NB的作用機(jī)制提供了新的線索，同時(shí)也為腫瘤的治療帶來(lái)新的理念。但本研究為體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，距離臨床應(yīng)用尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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