白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及其對(duì)細(xì)胞骨架的影響①

王光蘭 陳 爽 王心蕊 石英愛 張麗紅 劉曉會(huì) 吳 珊

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130021）

白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及其對(duì)細(xì)胞骨架的影響①

王光蘭 陳 爽 王心蕊②石英愛 張麗紅 劉曉會(huì) 吳 珊

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130021）

目的:觀察白細(xì)胞介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及其對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)作用。方法:選擇永生化的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK52E,經(jīng)體外培養(yǎng)后以 IL-1β（30μg/L）分別誘導(dǎo)3天及 6天,觀察細(xì)胞形態(tài);RT-PCR半定量檢測(cè)細(xì)胞α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和細(xì)胞骨架成分β-actin、α-tubulin的mRNA表達(dá);免疫熒光染色觀察α-SMA蛋白表達(dá)及骨架蛋白β-actin、α-tubulin在細(xì)胞內(nèi)的分布及排列。結(jié)果:培養(yǎng)的NRK52E細(xì)胞經(jīng)IL-1β體外誘導(dǎo)3天及6天后,細(xì)胞中α-SMAmRNA及蛋白表達(dá)水平與相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞比較明顯增多（P＜0.001）,提示NRK52E上皮細(xì)胞出現(xiàn)了表型轉(zhuǎn)化,此時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了改變,由典型的多邊鋪路石樣變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣,并有多個(gè)突起,細(xì)胞骨架蛋白β-actinmRNA的表達(dá)也稍有增多（P＜0.05）;其蛋白的分布排列也發(fā)生了改變,由胞膜轉(zhuǎn)移至核周及胞漿,形成束狀纖維樣結(jié)構(gòu)。但I(xiàn)L-1β誘導(dǎo)組細(xì)胞的另一個(gè)骨架蛋白α-tubulinmRNA表達(dá)和分布與對(duì)照組比較無明顯不同。結(jié)論:IL-1β能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的NRK52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,此過程中細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣,多突起;骨架蛋白β-actin也表達(dá)增加,并出現(xiàn)了骨架重建;而α-tubu lin在此過程中則沒有明顯變化。

白介素 1β ;轉(zhuǎn)分化 ;α-SMA;β-actin;α-tubulin

越來越多的研究顯示腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型 轉(zhuǎn)化（EMT）是參與腎纖維化的重要因素之一[1],無論是在免疫性的還是非免疫性的腎臟疾病模型中,腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的積聚與腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展具有明顯相關(guān)性[2,3]。白介素1β（IL-1β）作為巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎性介質(zhì),很可能在腎小管間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮作用,有報(bào)道IL-1β可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,成為肌成纖維細(xì)胞[4]。為進(jìn)一步明確IL-1β的促腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用,本研究以大鼠永生化腎小管上皮細(xì)胞株NRK52E為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察IL-1β促進(jìn)NRK52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用,同時(shí)觀察在其轉(zhuǎn)分化過程中是否伴有細(xì)胞骨架的改變,為IL-1β促腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化可能的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)細(xì)胞 永生化大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK52E購于中科院上海細(xì)胞庫,培養(yǎng)在含10%優(yōu)級(jí)胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液中。

1.2 主要試劑 優(yōu)級(jí)胎牛血清（Hyclone）;H-DMEM培養(yǎng)基（Gibco）;α-SMA,β-actin,α-tubulin 多克隆抗體（北京博奧森）;FITC-IgG,CY3-IgG（北京中衫）;RNA抽提試劑,逆轉(zhuǎn)錄試劑,PCR試劑盒（TaKaRa）;重組白細(xì)胞介素1β（Perprotech INC）。

1.3 引物 采用Primer primier 5.0設(shè)計(jì)并由上海生工合成,具體序列見表1。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) NRK52E細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%、CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基為H-DMEM+10%胎牛血清（FBS）,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.05%胰酶消化后以適當(dāng)濃度重新接種,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組:對(duì)照組3%FBS+H-DMEM+PBS;誘導(dǎo)組3%FBS+H-DMEM+IL-1（30μg/L）,分別作用3天和6天,各組細(xì)胞數(shù)及培養(yǎng)液體積均相等,隔天換液。

1.5 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察 培養(yǎng)細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察,比較不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)并照相記錄。

1.6 RT-PCR檢測(cè)α-SMA 和細(xì)胞骨架蛋白β-actin、αtubulinmRNA的表達(dá) 根據(jù)Tri Reagent說明書提取細(xì)胞總 RNA,測(cè)A 260/A280在1.8～2.0之間,說明RNA純度較高,根據(jù)OD260值計(jì)算RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈,以等量cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參,GAPDH、α平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、β-actin 和 α-tubulin的反應(yīng)條件均為:94℃變性2分鐘,然后進(jìn)入循環(huán),94℃30秒,55℃30秒,72℃40秒,最后72℃延伸5分鐘。循環(huán)數(shù)分別為:26、36、26、28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)成像后,用GEL-Pro4圖像分析軟件進(jìn)行灰度掃描,以IOD代表其表達(dá)量,用GAPDH的量進(jìn)行校正,以目的基因與GAPDH比值的相對(duì)量進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光染色

1.7.1 細(xì)胞爬片制備 預(yù)先在24孔板中放置無菌小蓋玻片,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,細(xì)胞收集和分組同上,分別誘導(dǎo)3天和6天后取蓋玻片經(jīng)4%多聚甲醛固定10分鐘,-20℃冷甲醇繼續(xù)固定20分鐘,PBS洗3遍,備用。

1.7.2 細(xì)胞免疫熒光染色 0.1%TritonX-100打孔,PBS洗5分鐘×3次;血清封閉37℃,30分鐘;分別加入一抗 ,即抗 α-SMA（1∶100）,抗 β-actin（1∶100）及抗α-tubulin（1∶100）抗體,37℃孵育1小時(shí);PBS洗5分鐘×3次,滴加相應(yīng)的二抗（1∶50）,常溫避光反應(yīng)30分鐘,PBS洗5分鐘×3次,激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)至第6天始終未發(fā)生形態(tài)改變,呈典型的多邊鋪路石樣,細(xì)胞間銜接緊密（見圖1A）。而誘導(dǎo)組細(xì)胞于誘導(dǎo)的第2天部分細(xì)胞即由原來的多邊鋪路石樣向成纖維細(xì)胞樣改變,誘導(dǎo)3～6天后大部分細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣,多突起,分散生長(zhǎng),部分細(xì)胞肥大變形,大小不一（見圖1B）。

2.2 IL-1β對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物α-SMA和細(xì)胞骨架蛋白β-actin、α-tubulin mRNA表達(dá)的影響 內(nèi)參GAPDH的mRNA表達(dá)條帶各組相同,經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞在誘導(dǎo)的第3天和第6天其α-SMAmRNA表達(dá)均明顯高于相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞。同時(shí)誘導(dǎo)組細(xì)胞在誘導(dǎo)第3天和第6天,細(xì)胞骨架蛋白β-actinmRNA表達(dá)與相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞相比也呈輕度增加狀態(tài),但另一骨架蛋白α-tubulinmRNA表達(dá)無論是誘導(dǎo)第

表1 引物序列及產(chǎn)物的長(zhǎng)度Tab.1 The sequences of the PCR amplication primers

3天還是第6天與其相應(yīng)的對(duì)照組相比均未見明顯改變（見圖2,表2）。誘導(dǎo)組細(xì)胞α-SMA mRNA和βactinmRNA表達(dá)的增加并未隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步加強(qiáng),即誘導(dǎo)組細(xì)胞誘導(dǎo)的第6天與誘導(dǎo)第3天相比,細(xì)胞α-SMA、β-actin mRNA的表達(dá)量未見明顯差異（數(shù)據(jù)未顯示）。

2.3 IL-1β對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)及對(duì)細(xì)胞骨架成分βactin、α-tubulin分布排列的影響

2.3.1 α-SMA 培養(yǎng)至第3、6天的對(duì)照組細(xì)胞 α-SMA表達(dá)極其微弱,其陽性部位主要位于細(xì)胞核周圍,經(jīng)IL-1β作用3天和6天的誘導(dǎo)組細(xì)胞,其細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)明顯增強(qiáng),不僅在核周有較強(qiáng)的熒光團(tuán)存在,在胞漿及細(xì)胞的突起中,也可見較強(qiáng)的α-SMA陽性的熒光物質(zhì)分布（見圖3A、B）。

圖1 相差顯微鏡下所見誘導(dǎo)6天的細(xì)胞形態(tài)（×100）Fig.1 The cellmorphology after stimulated by IL-1βfor 6 days on phase contrastm icroscope（×100）

圖2 IL-1β 對(duì) NRK52E細(xì)胞 α-SMA 和骨架 蛋白 β-actin、αtubulin的mRNA表達(dá)的影響Fig.2 The effect of IL-1β on expression ofα-SMA and skeleton protein β-actin,α-tubulin mRNA in NRK52E cells

2.3.2 β-actin 在培養(yǎng)的第3天和第6天,對(duì)照組細(xì)胞β-actin陽性染色主要積聚在細(xì)胞膜下,形成板層樣結(jié)構(gòu),細(xì)胞漿內(nèi)幾乎無β-actin陽性染色。經(jīng)IL-1β分別作用3天和6天后 ,誘導(dǎo)組β-actin的陽性染色發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為在細(xì)胞漿中出現(xiàn)較多βactin陽性的束狀纖維樣結(jié)構(gòu),連接細(xì)胞膜與細(xì)胞核,部分沿細(xì)胞長(zhǎng)軸縱行排列,細(xì)胞突起中也見絲狀排列的β-actin陽性染色,細(xì)胞膜下的板層樣結(jié)構(gòu)變薄甚至消失,在核膜周圍出現(xiàn)強(qiáng)陽性的β-actin熒光團(tuán)（見圖 3C、D）。

2.3.3 α-tubu lin IL-1β分別作用3天和 6天的誘導(dǎo)組細(xì)胞α-tubulin陽性染色與對(duì)照組細(xì)胞無明顯差異,均表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)α-tubulin陽性染色在核的一側(cè)分布較為密集,α-tubulin陽性的粗絲狀纖維以此為中心向周圍細(xì)胞漿放射并交叉成網(wǎng)狀,相互纏繞,似鳥巢（見圖3E、F）。

3 討論

腎小管間質(zhì)纖維化和慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)是許多慢性腎臟疾病發(fā)展到晚期的共同表現(xiàn),近幾年有研究表明在腎小管間質(zhì)纖維化的過程中,炎細(xì)胞產(chǎn)生的多種生物活性介質(zhì)均有誘導(dǎo)腎間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成肌成纖維細(xì)胞的能力,而肌成纖維細(xì)胞又是慢性腎間質(zhì)纖維化產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要來源細(xì)胞[5]。本實(shí)驗(yàn)我們選擇由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)IL-1β,在相關(guān)文獻(xiàn)[4,6]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了濃度篩選,確定30μg/L作為本實(shí)驗(yàn)的作用濃度,作用于體外培養(yǎng)的NRK52E細(xì)胞,首先檢測(cè)IL-1β體外誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力,結(jié)果顯示,NRK52E細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)3天后其細(xì)胞內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的特異標(biāo)志α-SMA在基因及蛋白水平上的表達(dá)均明顯增加,表明IL-1β能夠在體外誘導(dǎo)NRK52E腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。與此同時(shí)我們還觀察到培養(yǎng)的NRK52E細(xì)胞在發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的同時(shí),細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了明顯改變,由典型的多邊鋪路石狀變成多突起的成纖維細(xì)胞樣。

表2 IL-1β誘導(dǎo) 3天后 NRK52E細(xì)胞 α-SMA、β-actin 和 αtubulin mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 IL-1β induced relativemRNA exp ression ofα-SMA,βactin andα-tubulin in NRK52E cells after 3 days

圖3 IL-1β誘導(dǎo)6天后對(duì)NRK52E細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá),β-actin和α-tubulin分布排列的影響Fig.3 The expression ofα-SMA protein and the distributions and arrangements of β-actin and α-tubulin changes in NRK 52E cells after stimulated by IL-1βfor 6 days

眾所周知,細(xì)胞形狀的維持與細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和排列密切相關(guān),微絲和微管是細(xì)胞骨架的主要組成成分,它們與細(xì)胞形態(tài)的維持,細(xì)胞器的空間定位及位置的改變,細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等活動(dòng)密切相關(guān)[7]。因此本實(shí)驗(yàn)分別以微絲成分β-actin和微管成分α-tubulin作為觀察靶點(diǎn),觀察了IL-1β在誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的過程中對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)作用,RT-PCR結(jié)果顯示IL-1β在促進(jìn)NRK52E細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的同時(shí)其β-actin mRNA的表達(dá)也輕度增加。為進(jìn)一步研究IL-1β在促進(jìn)NRK52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程中對(duì)細(xì)胞骨架分布排列的影響,我們對(duì)β-actin和α-tubulin骨架蛋白進(jìn)行了免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)IL-1β使β-actin骨架蛋白的分布排列發(fā)生了明顯變化,其在細(xì)胞膜下形成的板層樣結(jié)構(gòu)變薄甚至消失,在胞核周圍積聚形成強(qiáng)陽性的β-actin熒光團(tuán),在細(xì)胞漿中形成較多的束狀纖維樣結(jié)構(gòu),連接細(xì)胞膜與細(xì)胞核,部分沿細(xì)胞長(zhǎng)軸縱行排列并伸入細(xì)胞突起中,說明在 IL-1β誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的過程中,微絲成分β-actin不僅在mRNA水平表達(dá)增多,還在分布及排列上發(fā)生了骨架重建,至于這些變化僅僅是 IL-1β誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化過程中的一種現(xiàn)象,還是βactin的骨架重建在轉(zhuǎn)分化過程中參與了信號(hào)傳導(dǎo)及蛋白調(diào)節(jié)作用尚需進(jìn)一步研究。作為細(xì)胞骨架的另一重要組成成分,微管蛋白α-tubulin無論在mRNA水平還是在分布排列上都未發(fā)現(xiàn)有明顯變化,可能是α-tubulin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及分布相對(duì)較為穩(wěn)定,IL-1β尚不能引起其明顯改變。

值得注意的是,目前很多的RT-PCR多是采用βactin、α-tubulin等骨架蛋白作為內(nèi)參,而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-1β誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中細(xì)胞內(nèi)的β-actinmRNA的水平也會(huì)發(fā)生改變,因此,在涉及該類實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)慎重選擇RT-PCR內(nèi)參。

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[收稿2009-11-20 修回2010-01-11]

（編輯 張曉舟）

Interleukin-1βinduced transdifferentiation of renal tubular epithelial cells and its effect on the cytoskeleton

WANGGuang-Lan,CHENShuang,WANGXin-Rui,SHIYing-Ai,ZHANGLi-Hong,LIUXiao-Hui,WUShan.KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To investigate the effectof interleukin-1β （IL-1β）on epithelial-mesenchymal transition（EMT）and cytoskeleton rearrangementof renal tubular epithelial cells.Methods:Immortalized renal tubular epithelial cell line NRK52Ewas cu ltured in vitrowith IL-1β（30 μg/L）for 3 days and 6 days,then the cellmorphology was observed;ThemRNA exp ressions of α-smooth muscle actin（α-SMA）,cytoskeleton componentsβ-actin and α-tubulinwere semi-quantitative exam ined by RT-PCR.The proteinexpression ofα-SMA and arrangementsof β-actin and α-tubulin were assessed by immunofluorescent staining.Results:After induced by IL-1β for 3 days and 6 days in vitro,themRNA and protein expressionofα-SMA increased significantly comparedwith corresponding control cells（P＜0.001）,it prompted that NRK52E cells underwent EMT;At the same time,the cellmorphology also changed,from a typicalmultilateral paving stone to fibroblast-like appearance,with mu ltiple processes;Cytoskeletal proteinβ-actinmRNA exp ression was also slightly increased（P＜0.05）.The distributions and arrangements ofβ-actin protein were also changed,from cellmembrane transferred to peri-nucleus and cytoplasm,moreover it formed fiberbundle-like structures.However,another cytoskeleton protein α-tubu lin in IL-1β induced cells,neither it'smRNA expression nor it's distribution had significant differences comparedwith the controlgroup.Conclusion:IL-1βcan induce NRK52E cellsundergoing EMT in vitro,cellmorphology changesinto fibroblast-like appearancewithmultiple processes,and also the cytoskeleton proteinβ-actin expression increases and rearrangementoccurrs.However,there was no changes onα-tubu lin.

Interleukin-1β ;Transdifferentiation;α-SMA;β-actin;α-tubulin

R329.2

A

1000-484X（2010）03-0210-04

①本文為教育部高校優(yōu)秀青年教師獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃（201182）和吉林省衛(wèi)生廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金

②吉林大學(xué)人獸共患病研究所,長(zhǎng)春130061

王光蘭（1981年-）,女,在讀醫(yī)學(xué)博士,主要從事腎臟病理學(xué)研究;

及指導(dǎo)教師:吳 珊（1962年-）,女,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事腎臟病理研究。