Cyr61促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞增殖及炎癥因子調(diào)控研究①

林錦驃 吳娟娟 王 利 鄒 靜 沈佰華 李寧麗

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所,上海 200025）

Cyr61促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞增殖及炎癥因子調(diào)控研究①

林錦驃 吳娟娟 王 利②鄒 靜③沈佰華 李寧麗

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所,上海 200025）

目的:采用類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng),研究基質(zhì)蛋白Cyr61在RA滑膜細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制。方法:通過(guò)Real-time PCR、Westernblot和免疫組化檢測(cè)RA病人的滑膜組織和細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)情況;用3H-TdR摻入法檢測(cè)滑膜液（SF）對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的影響;用ELISA方法檢測(cè)RA患者滑膜液中Cyr61蛋白的水平。結(jié)果:RA病人的滑膜組織和細(xì)胞中高表達(dá)Cyr61;SF能刺激滑膜細(xì)胞發(fā)生明顯增殖;且RA患者滑膜液中含高濃度的Cyr61蛋白。用SiRNA干擾技術(shù)抑制滑膜細(xì)胞中Cyr61基因表達(dá),再加入滑膜液后,則滑膜細(xì)胞增殖明顯降低。同時(shí),將SF與anti-Cyr61抗體共同孵育后再刺激滑膜細(xì)胞,FLS也不再發(fā)生明顯增殖。進(jìn)一步研究滑膜液中與上調(diào)Cyr61表達(dá)有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)SF中IFN-γ和TNF-α具有上調(diào)Cyr61蛋白表達(dá)的作用。結(jié)論:Cyr61蛋白是促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖的重要調(diào)控基因;RA患者滑膜液中含有高濃度的炎癥因子IFN-γ和TNF-α,通過(guò)上調(diào)Cyr61蛋白表達(dá)而促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖,可能是促進(jìn)RA病理性滑膜增生的重要因素之一。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;滑膜液,Cy r61;滑膜纖維樣細(xì)胞;TNF-α/IFN-γ

Cyr61（Cysteine-rich 61）是一種分泌性基質(zhì)蛋白,由381個(gè)氨基酸殘基組成。最早于1985年被Lau等在用血清或血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）刺激小鼠BALB/c 3T3成纖維細(xì)胞時(shí)所發(fā)現(xiàn)。因其結(jié)構(gòu)中富含半胱氨酸（含10%的半胱氨酸殘基）而被命名為富含半胱氨酸Cyr61（Cysteine-rich 61）。Cyr61具有明顯的促有絲分裂活性和趨化性,可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化、胚胎發(fā)育形成,是生命活動(dòng)的基本蛋白[1-4]。目前,對(duì)于Cyr61的研究多集中在腫瘤中,而在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用尚無(wú)報(bào)道[5-7]。

本文在采用表達(dá)芯片技術(shù)對(duì)4例RA病人的滑膜組織進(jìn)行了表達(dá)基因表達(dá)譜的分析研究,發(fā)現(xiàn)Cyr61在RA患者的滑膜組織中顯著升高的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用RA滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)、增殖實(shí)驗(yàn)、基因敲除技術(shù)等,較為系統(tǒng)地研究了Cyr61在RA滑膜細(xì)胞增殖中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn):RA滑液中含有較高濃度的Cyr61蛋白,具有介導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞增殖的作用。而RA滑液中的炎癥因子TNF-α和IFN-γ能夠上調(diào)Cyr61表達(dá),這可能是導(dǎo)致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。這一研究為今后發(fā)現(xiàn)治療RA新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病人標(biāo)本 20例RA患者滑膜組織來(lái)自于上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的RA病人。所有病例的診斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（ARA）修訂的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[8]。其中女性 18例,男性 2例,年齡 40～60歲,病程平均（12±6）年。20例OA患者滑膜組織來(lái)自于上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的OA病人。所用病例符合Altam提出的關(guān)于OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。其中女性13例,男性7例,年齡40～60歲,病程平均（22±8）年。2例正?；そM織來(lái)自于本校第九人民醫(yī)院骨科,為外傷手術(shù)病人關(guān)節(jié)滑膜組織。上述患者滑膜組織用于體外培養(yǎng)（詳見(jiàn)下述）,部分組織用4%多聚甲醛固定后留作免疫組化,血清和滑膜液（SF）高速離心后取上清,-80℃儲(chǔ)存待用。本研究中所用臨床樣本,均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng) 將無(wú)菌獲取的滑膜組織用PBS清洗后,用無(wú)菌手術(shù)剪刀反復(fù)剪切成約1mm×1mm×1mm的組織塊,加入膠原酶Ⅱ（0.5mg/m l）,37℃、消化2小時(shí)后,經(jīng) 200目紗網(wǎng)過(guò)濾,離心去上清后,將細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成梭形并成片后,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代后,分別加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE 標(biāo)記的小鼠抗人CD11b進(jìn)行標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定。上述4種標(biāo)記均為陰性的細(xì)胞為成纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLS）用于本研究。

1.3 Cyr61表達(dá)檢測(cè)

1.3.1 Real-time PCR檢測(cè)Cyr61表達(dá) 采用ABI公司提供的軟件prism2.0設(shè)計(jì)所檢測(cè)基因表達(dá)引物,序列見(jiàn)表1。Real-time PCR操作與結(jié)果分析同以前報(bào)道[10]。簡(jiǎn)述之:收集滑膜組織與FLS,用Trazol提取RNA,經(jīng)隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,將熒光染料SYBRGreen和目的基因Cyr61與內(nèi)參GADPH的引物混勻后,加入 Real-time PCR檢測(cè)板、密封、上機(jī)檢測(cè)（ABI 7900）。所采用的反應(yīng)條件為:50℃2分鐘,95℃10分鐘,95℃15秒,60℃60秒,共 40個(gè)循環(huán)。根據(jù)PCR反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度Ct值計(jì)算每個(gè)樣本的Cyr61基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR檢測(cè)基因及引物序列Tab.1 Gene and primer sequence for Real-time PCR

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)滑膜組織Cyr61表達(dá)將所獲取的滑膜組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水、包埋、切片固定等常規(guī)方法獲得滑膜組織切片。經(jīng)常規(guī)二甲苯脫臘、梯度酒精脫苯、洗滌后進(jìn)行Cyr61免疫組化染色。簡(jiǎn)述之:首先用兔血清封閉切片的非特異性抗原、去血清后加1∶50的羊抗人Cyr61多克隆抗體（Sant Cruz,USA）及抗人IgG作為空白對(duì)照,4℃過(guò)夜后,洗滌、加生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG,室溫20分鐘后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素標(biāo)記抗體,經(jīng)DAB緩沖液顯色,中止后用蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水,透明封片。顯微鏡下拍照（×40）,并采用圖像分析法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.3 Western blot檢測(cè)FLS細(xì)胞Cyr61蛋白表達(dá)常規(guī)Western blot方法檢測(cè)FLS中Cyr61表達(dá)。

1.4 ELISA方法檢測(cè)滑膜液中Cyr61蛋白 采用自制的鼠抗人Cyr61單克隆抗體（將另文報(bào)道）包被ELISA板,其余同常規(guī)ELISA方法。簡(jiǎn)述之:鼠抗人Cyr61單克隆抗體包被（1μg/孔）并于4℃過(guò)夜,次日用1%BSA-PBS封閉2小時(shí),加入RA患者滑膜液及骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液各30份及RA患者血清20份,

100μl/孔。同時(shí)加入倍比稀釋的hCyr61標(biāo)準(zhǔn)蛋白（200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、0 ng/ml）。經(jīng)37℃孵育1小時(shí)后,加入市售羊抗人Cyr61抗體（Sant Cruz,USA）100μl/孔,孵育后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體工作液、OPD底物顯色、終止反應(yīng)后于酶標(biāo)儀上測(cè)定OD（492 nm）值,根據(jù)hCyr61標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定的OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),獲得待測(cè)樣品中Cyr61蛋白濃度。

1.5 成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和抗體中和實(shí)驗(yàn)將 FLS接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔2×103cells/孔/200μl。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 12小時(shí)后,加入不同稀釋度的RA滑膜液,繼續(xù)孵育24小時(shí),加入3H-TdR（1μCi/孔）,再培養(yǎng) 18小時(shí),收集細(xì)胞,加液體閃爍液,β計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值?？贵w中和實(shí)驗(yàn):FLS接種至96孔培養(yǎng)板中,將抗人Cyr61單抗按照 1∶25、1∶50、1∶100 比例加入 SF 中混勻 ,同時(shí)設(shè)無(wú)關(guān)單抗（1∶25）為對(duì)照。經(jīng)與滑膜細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加3H-TdR（1μCi/孔）,再培養(yǎng)18小時(shí),收集細(xì)胞,加液體閃爍液,β計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值以觀察FLS的增殖作用變化。

1.6 Cyr61 SiRNA干擾實(shí)驗(yàn) 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù),人工合成隨機(jī)SiRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）3對(duì)。采用Real-time PCR對(duì)于所合成的SiRNA干擾效果進(jìn)行篩選。選用干擾效果達(dá)70%的SiRNA進(jìn)行Cyr61干擾實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)述之:在5×104FLS中加入轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectin 2000,USA）與對(duì)照 SiRNA（稱(chēng)SiNC）和 Cyr61特異性 SiRNA（SiCyr61）,混勻后,37℃、5%CO2培養(yǎng),24～48小時(shí)后,取被干擾細(xì)胞進(jìn)行Cyr61相對(duì)表達(dá)量檢測(cè),檢測(cè)干擾效果和對(duì)于滑膜細(xì)胞增殖的影響（滑膜細(xì)胞增殖測(cè)定方法同上）。

1.7 細(xì)胞因子刺激和抗體中和實(shí)驗(yàn) 將重組人IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α加入培養(yǎng)的 FLS中 ,8小時(shí)后Real-time PCR檢測(cè)Cyr61的mRNA表達(dá)水平。所用細(xì)胞因子濃度為:IL-10 0.1 ng/ml,IL-12 0.5 ng/ml,IFN-γ0.05 ng/ml,TNF-α0.05 ng/ml,滑膜液（1∶5 稀釋?zhuān)┳鳛殛?yáng)性對(duì)照。細(xì)胞因子抗體阻斷實(shí)驗(yàn):將抗IFN-γ（10 μg/m l）和抗 TNF-α（200 ng/ml）分別與IFN-γ、TNF-α、滑膜液混勻后加入滑膜細(xì)胞共同孵育,8小時(shí)后檢測(cè)Cyr61的mRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Grafpphad prism 5.0進(jìn)行作圖和分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA患者滑膜組織中Cyr61表達(dá)增高 本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cyr61基因在RA滑膜組織中表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人和骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者滑膜組織（圖1A）,為明確RA病人FLS中Cyr61的表達(dá)情況,我們應(yīng)用Real-time PCR分析了10例RA患者外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞及滑膜組織中Cyr61mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果可見(jiàn):RA患者的滑膜組織Cyr61基因的相對(duì)含量比RA患者的外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞以及正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞分別高8.7倍、125倍及13.3倍（P＜0.05）,證實(shí)了基因芯片的結(jié)果。進(jìn)一步用免疫組化染色的方法觀察了Cyr61在滑膜組織不同細(xì)胞中的分布及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與OA及正?；そM織相比,RA患者滑膜襯里層和襯里下層巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞浸潤(rùn),血管增生,大量淋巴細(xì)胞,漿細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn),淋巴濾泡形成伴纖維素樣壞死,FLS增生,而OA與正常人滑膜組織僅少量Cyr61表達(dá)（圖1C）。采用圖像分析證實(shí)了這一結(jié)果（圖1D）。

圖1 RA患者組織及細(xì)胞中Cyr61基因的相對(duì)含量表達(dá)格局Fig.1 Relativeexpression of Cyr61 in synovial tissues and cells of RA patients

圖2 體外培養(yǎng)的RA FLS中高表達(dá)Cyr61Fig.2 Overexpression of Cyr61 in RA FLS in vitro

2.2 RA病人滑膜成纖維細(xì)胞Cyr61表達(dá)增高 為深入研究RA患者滑膜細(xì)胞中Cyr61表達(dá)與作用機(jī)理,我們?cè)隗w外培養(yǎng)了滑膜細(xì)胞（FLS）并用Real-time PCR分析了FLS中Cyr61mRNA的表達(dá)格局。結(jié)果可見(jiàn):在RA患者的FLS中Cyr61基因的相對(duì)含量明顯高于滑膜組織（圖2A）,說(shuō)明Cyr61主要在RA滑膜組織的成纖維樣滑膜細(xì)胞中表達(dá)增高;同時(shí)我們還比較了RA、OA和正常人培養(yǎng)至第3代的FLS中Cyr61mRNA的表達(dá)水平。如圖2B所示,在RA患者的FLS中Cyr61基因的相對(duì)表達(dá)量比OA患者和正常人的FLS分別高3.5倍、20倍,從mRNA水平上證實(shí)了Cyr61在 RA病人 FLS表達(dá)增高。進(jìn)一步用Western blot的方法對(duì)RA、OA和正常人的FLS進(jìn)行Cyr61蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果表明 RA FLS中Cyr61表達(dá)水平明顯高于OA和正常人FLS,從而驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果,更加證明Cyr61主要表達(dá)在滑膜的成纖維樣細(xì)胞中（圖2C）。

2.3 RA的滑膜液（SF）刺激FLS增殖與Cyr61表達(dá)為了觀察局部炎癥環(huán)境對(duì)于FLS的生物學(xué)效應(yīng)和Cyr61表達(dá)的影響,我們將RA患者的滑膜液（SF）加入培養(yǎng)的細(xì)胞中,采用Real-time PCR和Western blot觀察滑膜液對(duì)FLS中Cyr61mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明:RA滑膜液能夠促進(jìn)FLS中Cyr61mRNA和蛋白表達(dá)（圖3A）。進(jìn)一步采用3H-TdR摻入法,觀察不同濃度滑液對(duì)于RA-FLS增殖的影響。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,各劑量組滑膜液均能促進(jìn)RA FLS增殖并呈劑量依賴(lài)性（圖3B）。

圖3 不同濃度滑膜液對(duì)于FLS Cyr61表達(dá)和增殖的影響Fig.3 Enhancement of FLSexp ression of Cyr61 and proliferation by synovial fluid

圖4 RA滑液中Cyr61含量與抗Cyr61抗體阻斷實(shí)驗(yàn)Fig.4 Concentration of Cyr61 in RA SF and anti-Cyr61 neutralization assay

2.4 RA患者SF中Cyr61濃度增高,抗Cyr61抗體能夠阻斷SF促進(jìn)FLS增殖 由于Cyr61是一種分泌性蛋白,具有明顯的促有絲分裂活性,可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖。而我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)RA病人滑膜細(xì)胞中高表達(dá)Cyr61蛋白,為此我們采用本室制備的鼠抗人Cyr61單抗檢測(cè)RA SF（n=30）中Cyr61蛋白的含量,并與OA SF和RA患者外周血清相對(duì)比。結(jié)果顯示:RA SF中Cyr61蛋白明顯高于對(duì)照OA SF,RA患者外周血（圖 4A）。而進(jìn)一步采用抗人Cyr61單抗進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn):Cyr61單克隆抗體能夠中和RA-SF刺激滑膜細(xì)胞增殖的作用,并且呈劑量依賴(lài)性。當(dāng)RA-SF稀釋到1∶100,阻斷作用基本消失（圖4B）。表明Cyr61蛋白具有刺激滑膜細(xì)胞增殖作用。

圖5 Cyr61特異性基因干擾實(shí)驗(yàn)圖Fig.5 Specific Cyr61 SiRNA in RA FLS

圖6 IFN-γ和TNF-α均可上調(diào)RA FLS中 Cyr61的表達(dá)Fig.6 Elevated expression of Cyr61 by IFN-γand TNF-αin RA FLS

2.5 特異性基因干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Cyr61具有促進(jìn)FLS增殖作用 我們分別設(shè)計(jì)了3條針對(duì)人Cyr61基因的雙鏈小RNA（SiRNA）,同時(shí)用與哺乳動(dòng)物無(wú)關(guān)的SiRNA作為陰性對(duì)照（SiRNA of Negative control,siNC）。用脂質(zhì)體（Lipofectin2000）將SiRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,光學(xué)顯微鏡圖和熒光顯微鏡觀察表明轉(zhuǎn)染率達(dá)80%～90%。用Real-time PCR檢測(cè)干擾24小時(shí)后Cyr61的表達(dá)水平,其中H-3是針對(duì)人Cyr61的特異性SiRNA,抑制率約為 70%～80%（圖5A）,因此,選用這一SiRNA進(jìn)行FLS增殖實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步觀察了干擾的最佳時(shí)間,發(fā)現(xiàn)干擾24小時(shí)效果最好（圖5B）。因此,采用干擾24小時(shí),結(jié)果表明當(dāng)FLS中Cyr61表達(dá)受到干擾時(shí),FLS受到滑液刺激后的增殖明顯降低（圖5C）,提示Cyr61是介導(dǎo)SF刺激后滑膜細(xì)胞增殖的重要基因。

2.6 RASF中 IFN-γ和TNF-α可上調(diào)Cyr61表達(dá)由于SF中含有高濃度的細(xì)胞因子[11],為了明確這些細(xì)胞因子是否與Cyr61上調(diào)有關(guān),本研究中用純化的細(xì)胞因子分別刺激RA FLS,觀察其Cyr61的表達(dá)情況。為了模擬其在體內(nèi)的作用,細(xì)胞因子的濃度選擇為在SF中能夠檢測(cè)到的濃度。結(jié)果表明:IFN-γ和TNF-α能夠上調(diào)Cyr61的表達(dá)（圖 6A）。為了明確該兩種細(xì)胞因子的作用,進(jìn)而采用阻斷抗體anti-IFN-γ（10μg/ml）和 anti-TNF-α（200 ng/ml）分別與SF混勻,在刺激8小時(shí)后收集培養(yǎng)的細(xì)胞,使用Real-time PCR的方法檢測(cè)其Cyr61的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:用IFN-γ和TNF-α抗體阻斷后,SF的刺激作用也明顯下降,聯(lián)合阻斷的作用更明顯（圖6B）。

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoida athritis,RA）是一種以滑膜組織炎性增生、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病。其病因尚不明確,最近研究發(fā)現(xiàn),除了細(xì)胞因子和Th1/Th2細(xì)胞失衡外,非T細(xì)胞成分如FLS（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性,RA異常增生的滑膜組織類(lèi)似于局限性侵襲生長(zhǎng)的腫瘤,造成關(guān)節(jié)的破壞[12-15]。有研究報(bào)道,滑膜組織增生與癌基因和凋亡相關(guān)基因具有相關(guān)性,但Cyr61在RA滑膜組織增生中的作用,尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用表達(dá)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cyr61基因在RA滑膜組織中表達(dá)增高。為進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果,我們應(yīng)用Real-time PCR分析了RA患者外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞,以及完整滑膜組織中Cyr61的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RA患者的滑膜組織Cyr61基因的相對(duì)含量高于患者的外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞以及正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞。證實(shí)了用表達(dá)芯片所獲得結(jié)果。而用免疫組化也證實(shí)了只有RA滑膜組織高表達(dá)Cyr61,蛋白表達(dá)主要存在于滑膜襯里層細(xì)胞及襯里下層血管內(nèi)皮細(xì)胞、FLS。而OA患者和正常人的滑膜組織細(xì)胞中Cyr61表達(dá)比較微弱,并只分布在滑膜襯里層細(xì)胞中。

為了深入研究Cyr61在RA滑膜組織中高表達(dá)的病理意義,我們首先建立了RA滑膜細(xì)胞的體外原代培養(yǎng),并獲得純化（原代培養(yǎng)第3代后）的纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）。在基因和蛋白水平上與OA和正常人滑膜組織的FLS進(jìn)行比較,明確了RA FLS中Cyr61的表達(dá)明顯高于OA和正常人FLS。在此基礎(chǔ)上,我們研究了Cyr61表達(dá)與關(guān)節(jié)滑膜液、FLS增殖及與炎癥因子的關(guān)系。

我們首先用不同濃度的滑膜液刺激體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)RA的SF能上調(diào)FLS中Cyr61表達(dá),同時(shí)促進(jìn)FLS增殖,而且Cyr61表達(dá)和FLS增殖均與滑液加入量呈正相關(guān),即表現(xiàn)出典型的劑量依賴(lài)性。由于RA FLS中高表達(dá)Cyr61蛋白,而Cyr61又是一種分泌蛋白,因此我們推測(cè)RA SF中可能存在Cyr61蛋白,這一推測(cè)通過(guò)ELISA檢測(cè)了RA和OA SF中Cyr61的含量得到證實(shí):RA SF中Cyr61蛋白含量明顯高于對(duì)照OA SF和RA患者外周血。而將抗Cyr61單克隆抗體加入SF,用于中和Cyr61作用,結(jié)果顯示這種處理后,SF刺激FLS增殖的能力明顯下降,說(shuō)明Cyr61的確能夠增強(qiáng)SF刺激FLS增殖的作用。

RNA干擾（RNA interference,RNAi）是近幾年才發(fā)現(xiàn)的一種生物學(xué)現(xiàn)象,它由長(zhǎng)21～23個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA介導(dǎo),通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致序列特異的基因沉默。目前,RNA干擾已被廣泛應(yīng)用于探索基因功能、防治病毒感染以及治療腫瘤[16-18]。小干擾RNA（Small interfering RNA,SiRNA）抑制效率高,可達(dá)90%以上,而且沒(méi)有明顯的毒副作用。因此是近年應(yīng)用最為廣泛的特異性基因功能研究方法。我們針對(duì)Cyr61mRNA三個(gè)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)了三組SiRNA,并通過(guò)干擾后Cyr61表達(dá)變化篩選出干擾效率最高的Cyr61特異性SiRNA。用這一SiRNA轉(zhuǎn)染FLS,干擾FLS中Cyr61基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)SiRNA干擾后,再用SF刺激,FLS增殖明顯下降,證實(shí)了Cyr61的確是介導(dǎo)FLS增殖的關(guān)鍵基因。

由于RA SF中含有多種高濃度的細(xì)胞因子為RA滑膜炎提供了重要的微環(huán)境,在RA的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[19,20]。我們推測(cè)SF中含有某些炎性細(xì)胞因子可能參與了Cyr61表達(dá)的上調(diào)。為了驗(yàn)證這一想法,我們用純化的細(xì)胞因子IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α分別刺激FLS,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有IFN-γ和TNF-α能夠上調(diào)FLS中Cyr61表達(dá)。進(jìn)一步采取抗IFN-γ和抗TNF-α中和抗體分別或同時(shí)與SF預(yù)孵育,以達(dá)到中和 SF中TNF-α和 IFN-γ的目的,然后再用這種預(yù)處理的SF刺激FLS,結(jié)果顯示此時(shí)的SF刺激FLS增殖的作用明顯下降。提示:RA SF含有的高濃度TNF-α和IFN-γ能夠通過(guò)上調(diào)滑膜細(xì)胞中Cyr61表達(dá),繼而,Cyr61促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生。

關(guān)于滑膜組織增生與癌基因和凋亡相關(guān)基因的關(guān)系已有研究報(bào)道[21-23],但是Cyr61與RA滑膜細(xì)胞增殖則未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次報(bào)道了Cyr61蛋白介導(dǎo)RA滑膜增殖,而SF中的炎癥因子TNF-α和IFN-γ能夠上調(diào)Cyr61表達(dá)。這可能是導(dǎo)致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。這為今后進(jìn)一步篩選治療RA新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是,關(guān)于Cyr61如何促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖及其調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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[收稿2009-11-08]

（編輯 張曉舟）

Cyr61 promotes proliferation of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis and its regulation by inflammatory factor

LINJin-Piao,WUJuan-Juan,WANGLi,ZOUJing,SHENBai-Hua,LINing-Li.ShanghaiInstituteofImmunology,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

Objective:To investigate the effectof Cyr61 on the proliferation of Fibroblast-like Synoviocytes（FLS）in rheumatoid arthritis（RA）.Methods:Cyr61 expression in synovial tissues（ST）and FLSwas examined using Real-time PCR,Westernb lot and immunohistochemistry simultaneously.FLSwere isolated from synovial tissueof RA patients and cultured in vitro.The proliferation of FLSstimulated with synovial fluid（SF）was determined by3H-TdR incorporation.Cyr61 protein level in RA SF was detected by ELISA.Results:Cyr61 was over expressed in ST,FLSof RA patientswhilehardly examined in normal individuals and osterarthritis（OA）patients.Meanwhile,Cy r61 protein level was elevated in SF,which promoted the proliferation of RA FLS.This proliferation was abrogated by knockdown the Cyr61 gene of FLS or neutralizingmonoclonal antibody againsthuman Cyr61.Moreover,inflammatory factor IFN-γand TNF-αup-regulated the expressionof Cyr61.Conclusion:These results indicate that the elevated level of IFN-γand TNF-αin RA SF can promote the proliferation of the FLS derived from RA patients by increasing expression of Cyr61,suggesting that Cyr61may play an important role in the development of RA.

Rheumatoid arthritis;Synovium fu lid,Cyr61;Fibroblast-like synoviocytes;TNF-α/IFN-γ

R392

A

1000-484X（2010）03-0264-06

①本文受?chē)?guó)家自然基金（30872990）、863項(xiàng)目（2008AA02Z429）、上海市科委（08JC1413200）、上海市教委（J50207）、仁濟(jì)醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院合作研究基金項(xiàng)目（PY07011）資助

②上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,上海200025

③上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院呼吸科,上海200025

林錦驃（1985年-）,男,在讀碩士,主要從事自身免疫與免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:jinpiaolin@yahoo.com.cn;

及指導(dǎo)教師:李寧麗（1957年-）,女,博士,教授,主要從事自身免疫與免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:ninglixiaoxue57@yahoo.com.cn。