楊建偉,曹維偉

(山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局,山東壽光262700)

由布魯氏菌屬細菌引起的奶牛布魯氏菌病是以感染家畜為主的人獸共患的傳染病,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動物疫病,我國將其列為二類動物疫病。奶牛布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患的接觸性傳染病。主要侵害奶牛生殖道,引起子宮、胎膜、關(guān)節(jié)、睪丸及附睪的炎癥;母牛臨床發(fā)生胎衣停滯、流產(chǎn)及繁殖障礙。在人會引起發(fā)熱,盜汗,無力,關(guān)節(jié)、頭和全身疼痛[1]。奶牛布魯氏菌病檢測方法很多,幾乎所有的細菌學(xué)檢測方法在布病的檢測中都有過應(yīng)用和研究,而且隨著血清學(xué)實驗技術(shù)和生物工程技術(shù)的發(fā)展,奶牛布魯氏菌病檢測技術(shù)的研究也取得了新的進展,現(xiàn)對近些年來奶牛布魯氏菌病的檢測技術(shù)研究作一概述,供同行參考。

1 病原學(xué)檢測

布氏菌屬的細菌是一組微小的球桿狀的革蘭氏陰性菌。寬0.3～ 0.6 μ,長0.6～1.5 μ。無芽胞 、無鞭毛、不形成莢膜。姬姆薩染色呈紫紅色,柯茲羅夫染色呈紅色,其他菌為綠色。布氏菌生長繁殖對營養(yǎng)要求較高,生長緩慢,分裂一次時間約132～227 min。尤其初代分離的野生株生長更慢,通常需5～7 d,有的甚至需20～30 d才可生長出可見的菌落。生長最適溫度為37℃,個別種型初代生長需一定濃度CO2。對所有流產(chǎn)奶牛都應(yīng)懷疑是布魯氏菌病并要進行調(diào)查,臨床癥狀不具特征性,而畜群史對診斷有幫助[2]。把胎盤子葉、陰道排泄物和胎兒肺、肝和皺胃內(nèi)容物進行涂片,加熱或酒精固定后,用改良的萋——尼氏、科斯特氏、革蘭氏或麥基亞維羅氏方法染色,或用熒光素或過氧化物酶標(biāo)記的抗體結(jié)合物染色。細胞內(nèi)出現(xiàn)大量堆積物,弱抗酸性布氏桿菌形態(tài)細菌或具有免疫特性著色的細菌,則可判定為布氏桿菌病。鑒于其他病原可能具有相似形態(tài)(如貝氏科可氏體、衣原體)或免疫學(xué)交叉反應(yīng)性(如耶爾森氏菌屬),因此解釋結(jié)果時應(yīng)謹(jǐn)慎[1]。

2 血清學(xué)試驗

2.1 虎紅平板凝集試驗(RBPT)

一種非常簡單的血清學(xué)試驗,只需在潔凈的玻璃板上取被檢血清0.03 mL與抗原0.03 mL混合,4 min內(nèi)判定結(jié)果,凡出現(xiàn)“+”以上凝集者均為陽性,出現(xiàn)陽性反應(yīng)的動物應(yīng)根據(jù)情況進行試管凝集試驗或其他輔助診斷試驗。

2.2 試管凝集試驗(SAT)

我國布病診斷的法定試驗。該試驗在試管內(nèi)進行。被檢血清用0.5%苯酚生理鹽水作12.5、25、50、100、200 倍稀釋,置于小試管中各 0.5 mL,將抗原用0.5%苯酚生理鹽水作1∶20稀釋,加入上述各管血清中0.5 mL,同時設(shè)陰、陽血清對照充分混合后置36～37℃溫箱中24 h,取出靜止15～20 min判定。血清1∶100凝集“++”以上為陽性,1∶50凝集“++”為可疑。

2.3 布病補體結(jié)合試驗(CFT)

一種特異性較高的血清學(xué)試驗,通常被檢動物群體經(jīng)過虎紅平板凝集試驗檢查后若出現(xiàn)可疑反應(yīng)動物,就需用SAT或CFT做進一步確診。該試驗是將被檢血清作成1∶10稀釋,加入2管中每管0.5 mL,再向其中1管加入0.5 mL工作濃度的抗原,此管為試驗管;另1管加0.5 mL生理鹽水作為對照管,然后各加0.5 mL的補體混勻,置于37℃水浴20 min,取出觀察結(jié)果0%～40%溶血為陽性,50%～90%溶血為可疑,100%溶血為陰性。注意稀釋后的抗原必須當(dāng)天用完。

以上三種診斷方法注意事項:試驗溫度應(yīng)在25～30℃條件下進行;所用器材一定要清潔,血清和抗原用量很少,必須用量精確;被檢血清自采血之日起不能超過15天,血清不能凝固腐敗[3]。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

目前市面上可以獲得幾種商品化的用不同抗原制劑,抗球蛋白酶結(jié)合物和底物顯色劑的多種間接ELISA試劑盒,如北京天之泰生物科技有限公司的血清ELISA試劑盒及武漢華美生物工程有限公司的牛布魯氏桿菌IgG抗體ELISA試劑盒等。這些方法通過廣泛的田間試驗已得到確認(rèn),而且正被廣泛使用。間接ELISA高度敏感,但不能鑒別流產(chǎn)布氏桿菌19號免疫接種產(chǎn)生的抗體和病原菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。因此,在檢測免疫接種過的牛時更應(yīng)將間接ELISA當(dāng)作一種篩選方法而不是確認(rèn)的方法[4]。采用流產(chǎn)布氏桿菌OPS表位之一的特異單克隆抗體所作的競爭ELISA較間接ELISA特異性更高[5～7]。競爭ELISA可以排除絕大多數(shù)流產(chǎn)布氏桿菌19株免疫接種產(chǎn)生的殘留抗體的反應(yīng)。如市面上的北京天之泰生物科技有限公司的競爭ELISA試劑盒,鑒別免疫動物與自然感染動物,敏感性98%～100%,特異性99.7%～100%。

2.5 熒光偏振試驗(FPA)

文獻稱熒光偏振試驗(FPA)仍有前景?；蛟S在合適的條件下該法適于應(yīng)用。這種方法是檢測抗原/抗體相互作用的一種簡便技術(shù),在實驗室或田間都可操作使用。本法屬同源性分析,分析物不需進行分離,因而該法快捷。試驗步驟如下:①10 mm×75 mm硼硅玻璃管中加1 mL PBSAL緩沖液。管中加10 mL血清或20 mLEDTA處理的血液,在熒光偏振分析儀上讀取光分布值。②以產(chǎn)生熒光強度250×103～300×103的抗原加到管中,混勻。每一批次都不同,但通?？傇?0 uL的范圍。室溫下孵育2 min后在熒光偏振分析儀上讀取第二個數(shù)值。③高于臨界值的讀數(shù)判為陽性反應(yīng)。④每批試驗中都應(yīng)包括:強陽性、弱陽性和陰性工作標(biāo)準(zhǔn)的血清(用OIE標(biāo)準(zhǔn)血清校準(zhǔn)過)。熒光偏振試驗診斷牛布氏桿菌的特異性和敏感性幾乎與競爭ELISA相同。診斷新近免疫過流產(chǎn)布氏桿菌19株的牛的特異性大于99%[8]。

3 聚合酶鏈反應(yīng)方法(PCR)

PCR是近來發(fā)展成熟起來的一種體外基因擴增技術(shù),能在數(shù)小時內(nèi)使DNA呈指數(shù)增加,已成功地用于多種細菌疾病的基因檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查等。其檢測原理為:尋找傳染性因子的特異DNA序列,對待測樣品進行PCR擴增。如果檢測出了相應(yīng)的擴增帶,則判為陽性反應(yīng);反之,無擴增帶則為陰性反應(yīng)。在布病研究中,采用PCR技術(shù)檢查布氏菌始見于1990年。在國際上,于1995年和1996年將PCR技術(shù)用于布病的診斷探索。在國內(nèi),1995年中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所開始這方面的研究,1997年首次將PCR應(yīng)用于布病病人的診斷。目前,各國各實驗室所報道的結(jié)果極不一致,差異很大[9]。用PCR技術(shù)檢測布氏菌的特異性和敏感性研究已經(jīng)報道很多。用PCR來檢測奶牛布魯氏菌病在病的早期、快速、微量等病原學(xué)診斷方面具有目前常規(guī)的血清學(xué)檢測及細菌培養(yǎng)無可比擬的優(yōu)越性。市面上已有的PCR快速診斷試劑盒如長沙安迪生物有限公司的奶牛布魯氏菌病的PCR快速診斷試劑盒等反應(yīng)良好。

4 膠體金檢測技術(shù)

膠體金標(biāo)記檢測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù),已廣泛應(yīng)用于病毒、細菌及寄生蟲病的免疫診斷方面。此方法檢測奶牛布魯氏菌病與其他方法比較。ELISA方法雖具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點,但操作繁瑣、耗時多,需要一定的儀器,在基層推廣受到一定限制;PCR技術(shù)用于布病的診斷,因敏感性差,有待提高;試管凝集試驗(SAT)雖是一種經(jīng)典布病免疫診斷方法,具有較高的敏感性和特異性,但其操作步驟比較復(fù)雜,使用器械多,血清用量大,檢測時間長,需花費較多的人力和物力;膠體金標(biāo)記檢測技術(shù)具有敏感性強,特異性高優(yōu)點,且操作簡便,不需任何儀器,血清用量少,檢測速度快,更適合于布魯氏菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場應(yīng)用,為布病的檢測提供一種新的手段[10]。目前市面上已有布病膠體金檢測試紙條銷售,但價格還比較昂貴。

5 其他方法

5.1 全乳間接ELISA

篩查奶牛群的一個極其有效的方法是檢測大罐乳。這種來源的乳樣比血樣既便宜又容易多次采集。當(dāng)檢驗出陽性后,所有供奶的牛都應(yīng)作血液檢測。全乳間接ELISA是最敏感和最特異的方法,尤其在檢測大群牛時更有價值。若作ELISA不方便,全乳環(huán)狀試驗(M RT)是一種合適的選樣方法。也可用間接ELISA檢測個體動物[11]。如同血清間接ELISA,有多種全乳間接ELISA可采用,有幾種商品化的間接ELISA試劑盒,已在廣泛的田間試驗中得到驗證,且正在廣泛應(yīng)用。如北京天之泰生物科技有限公司的奶樣ELISA試劑盒及武漢華美生物工程有限公司的牛布魯氏桿菌IgG抗體ELISA試劑盒等。

5.2 全乳環(huán)狀試驗(MRT)

對泌乳動物,全乳環(huán)狀試驗可用來篩查牛群的布氏桿菌病。對大群牛(多于100頭泌乳牛),本試驗的敏感性會降低其可靠性。對新近免疫的牛(免疫后不超過4個月),或者對含有異常乳(如初乳或因患乳房炎而產(chǎn)生的異常乳)的樣品,可能會發(fā)生假陽性反應(yīng)。試驗時將1滴30 uL標(biāo)準(zhǔn)牛種布氏桿菌全乳環(huán)狀試驗抗原加到已在4℃保存24 h以上的1 mL全乳中,試管中乳樣高度至少25 mm以上。乳樣品不應(yīng)凍結(jié)、加熱或劇烈振蕩。全乳-抗原混合物與陽性和陰性對照一同在37℃作用1 h,不過,于4℃過夜孵育可增加試驗的敏感性,試驗容易判讀。當(dāng)乳柱頂部形成一個深藍色環(huán)時,則判為強陽性。對于乳和乳脂層界面出現(xiàn)藍色層,應(yīng)視作陽性。如果下部乳的顏色超過乳脂層的顏色,則判為陰性[12]。

5.3 布魯氏菌素皮膚試驗

取0.1 mL布氏桿菌素,在尾褶、肋腹部或頸側(cè)部皮內(nèi)注射,48～72 h判定試驗結(jié)果。局部腫脹變硬為陽性反應(yīng)。建議在注射前,應(yīng)用Vernier卡尺測量注射部位皮膚厚度,并于48～72 h后再檢查,強反應(yīng)易辨認(rèn),但弱反應(yīng)需要細心判斷[13]。盡管布氏桿菌素皮下試驗是布病診斷中最為特異的一種方法,不應(yīng)單獨依據(jù)畜群中少數(shù)動物出現(xiàn)陽性皮內(nèi)反應(yīng)而作出診斷,而應(yīng)有可靠的血清學(xué)試驗如ELISA進一步證實。

[1]賈幼陵.哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2002.

[2]秦發(fā)才,吳天保,滕進禮.奶牛布魯氏菌病診斷、處理的分析與思考[J].中國牛業(yè)科學(xué),2009,35(4):88-89.

[3]孫耀貴,黃美生,程 佳.三種血清學(xué)方法檢測奶牛布魯氏菌病的比較試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2005,(1):4-5.

[4]WrightP F,Tounkara K,Lelenta M,et al.International reference Standards:antibody standards for the indirect enzymelinked immunosorbent assay[J].Rev.Sci.T ech.2002,3:824-832.

[5]M acMillan A P,Greiser-Wilke I,M oennig V,et al.A competition enzyme immunoassayfo rbrucellosisdiagnosis[J].DtschTierarztl.Wocherschr,1990,97:83-85.

[6]Nielsen K,Kelly L,Gall D,et al.Improved competitive enzyme immunoassayfo rthediagnosisofbovinebrucellosis[J].Vet.Immunol.Immunopathol,1995,46:285-291.

[7]Stack J A,Perrett L L,Brew S D,et al.cELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples[J].Vet.Record,1997,145:735-736.

[8]Nielsen K,Gall D,Jolley M,et al.A homogenous fluorescence polarisation assay for detection of antibody to Brucella abortus[J].J.Immunol.Methods,1996,195:161-168.

[9]姜風(fēng)華,于 剛.布魯氏菌PCR快速檢測方法的建立[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)2008,(2):4-5.

[10]朱明東,楊 蓉,洪林娣,等.快速診斷布魯氏菌病膠體金免疫層析法的建立[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,(7):1344-1345.

[11]Pouillot R,Garin-Bastuji B,Gerbier G,et al.T he brucellin skin test as a tool to differentiate false positive serological reactions in bovine brucellosis[J].Vet.Res,1997,28:365-374.

[12]Adone R,Francia M,Ciuchini F,et al.A melitensis B115-based complement fixation test to detect antibodies induced by Brucella rough strains[J].J Appl Microbiol.2008,105(2):567-574.

[13]Ewalt D R,Bricker B J.Validation of the abbreviated Brucella as a rapid screening method for differentiationof Brucella abortus field strain isolates and the vaccine strains[J].J Clin Microbiol,2000,38:3085-3086.