呂 峰 郜玉峰 崔明芳 張振華 尹華發(fā)

在HBV感染中，T淋巴細(xì)胞作為主要的效應(yīng)細(xì)胞，與病毒的清除直接相關(guān)。但研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者常表現(xiàn)為免疫細(xì)胞功能低下，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能通過(guò)細(xì)胞直接接觸而抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等細(xì)胞的活性，在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在外周循環(huán)中的表達(dá)頻率和功能改變直接影響到細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱，從而決定抗病毒的療效。因此，本文通過(guò)研究CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在慢性乙型肝炎（CHB）、無(wú)癥狀HBsAg攜帶者（ASC）和肝炎肝硬化（LC）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的表達(dá)水平及其與不同臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，以探討其在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料與方法

一、研究對(duì)象 我科2008年9月至2009年3月門診和住院的CHB患者26例，ASC 15例，LC患者11例。男性42例，女性10例，平均年齡35±11歲。診斷均符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標(biāo)準(zhǔn)[1]。所有病例均未合并其他嗜肝病毒感染或其它慢性疾病，排除了重疊HIV感染，入組前3個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用任何抗病毒治療，無(wú)胸腺肽、免疫球蛋白、甘草酸類、聯(lián)苯雙脂等藥物治療史。另選16例正常對(duì)照者，男9例，女7例，平均年齡34±12歲。

二、主要儀器及試劑 FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；Centrifuge 5810R和5415R型離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；MODULAR—DPP型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自上海羅氏公司；7300型RT-PCR機(jī)購(gòu)自美國(guó)ABI公司。IgG-異硫氰酸熒光素（FITC）、IgG-藻紅蛋白 （PE）、IgG-葉綠素蛋白 （Percp）、抗CD25-FITC、抗CD4-PE、抗CD3-Percp試劑購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京Solarbio公司；RPMI-1640培養(yǎng)液為自行配制，干粉購(gòu)自美國(guó)Flow公司。

三、外周血T淋巴細(xì)胞亞群和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè) 新鮮采集的EDTA抗凝全血，應(yīng)用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含有10%牛胎血清的RPMI-1640培養(yǎng)濃集，37℃，5%CO2溫箱條件下培養(yǎng)24小時(shí)后收獲細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)取大約105細(xì)胞，加入人新鮮血清或IgG，放置30分鐘以封閉細(xì)胞表面Fc段受體，然后加入抗CD25-FITC、抗CD4-PE、抗CD3-Percp試劑表面染色，同時(shí)另取一管加入IgG-FITC、IgG-PE、IgG-Percp作為同型對(duì)照。4℃，避光放置30分鐘后用PAS洗三次，加固定液，再放置4℃避光30分鐘，上機(jī)檢測(cè)。使用CELLQUEST軟件進(jìn)行分析，以前向角散射光（FSC）為橫坐標(biāo)，側(cè)向角散射光（SSC）為縱坐標(biāo)，建立二維散點(diǎn)圖，在散點(diǎn)圖上調(diào)整閾值參數(shù)，排除碎片和噪聲的干擾，圈定淋巴細(xì)胞設(shè)門以獲取細(xì)胞。以同型對(duì)照分別設(shè)定不同熒光素的陰性界限，檢測(cè)并記錄熒光抗體染色陽(yáng)性CD3+和CD4+分子的表達(dá)情況。再以CD3-SS設(shè)門，將CD4+CD25+T細(xì)胞亞群作為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表型，分析門內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率，采用Winmdi Version2.8功能軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

四、臨床指標(biāo)的檢測(cè) 采用ELISA法（上?？迫A生物科技有限公司）檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物；采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能；采用熒光定量PCR法（廣州中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司）檢測(cè)HBV DNA。檢測(cè)結(jié)果以＞103copies/ml判斷為陽(yáng)性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組間數(shù)據(jù)取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有資料均使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例

CHB組、ASC組及正常對(duì)照組外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例分別為4.40±2.76%、4.43±2.10%和2.70±0.97%，CHB組和ASC組的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例較正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表 1。

表1 HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分率（%）

二、慢性HBV感染者HBeAg與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系 HBeAg陽(yáng)性組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+比例為4.17±2.30%，HBeAg陰性組為4.30±2.43%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.181，P＞0.05）。但兩組與正常對(duì)照組比較均有顯著性差異（P＜0.01），見(jiàn)表 2。

表2 HBeAg與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分率（%）的關(guān)系

三、慢性HBV感染者HBV DNA水平與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系 根據(jù)HBV DNA水平將患者分為高拷貝組（＞105copies/ml）和低拷貝組（＜105copies/ml）。結(jié)果HBV DNA高拷貝組患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+比例為4.23±2.12%，而HBV DNA低拷貝組為4.28±2.73%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能維持免疫耐受和抑制抗原特異性或非特異性T細(xì)胞應(yīng)答。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，在HBV感染者中針對(duì)HBV特異性的T細(xì)胞應(yīng)答的減弱可能與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用有關(guān)，并且與HBV感染后病毒的清除、病情進(jìn)展及臨床轉(zhuǎn)歸有密切的關(guān)系[1]。Franzese等[3，4]在慢性HBV感染者中發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)HBV特異性CTL細(xì)胞和Th細(xì)胞有抑制作用，并參與了HBV感染的慢性化過(guò)程。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平增高的原因可能與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面的一些負(fù)性共刺激因子過(guò)度表達(dá)有關(guān)，如 CTLA-4、PD-1、Galectin-9 等[5～8]可能影響它的表達(dá)水平和功能改變。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在CHB和ASC組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)率均顯著高于正常對(duì)照組，但CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)率在CHB、ASC和LC三組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），可能與病例數(shù)較少有關(guān)。對(duì)于CHB患者，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量是否增加仍存在爭(zhēng)議。Franzese等[3]發(fā)現(xiàn)免疫耐受患者、慢性活動(dòng)性乙型肝炎患者及無(wú)癥狀HBV攜帶者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量與健康對(duì)照之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些仍需大樣本觀察的驗(yàn)證。

我們的觀察結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎患者外周循環(huán)中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率與血清轉(zhuǎn)氨酶水平無(wú)相關(guān)性（資料未列出）。這與Xu等[9]通過(guò)對(duì)l6例AHB、76例CHB和29例慢性重型肝炎患者外周循環(huán)和肝臟中浸潤(rùn)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率、表型特征分子和對(duì)抗病毒應(yīng)答的影響等進(jìn)行研究的結(jié)果一致。本文發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)與外周血HBV DNA水平及HBeAg陽(yáng)性與否也無(wú)明顯的相關(guān)性，與沈俊輝等[10]研究結(jié)果相同，但與Stoop和Peng等[4，5]研究結(jié)果有所不同。他們報(bào)道CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞頻率與血清病毒載量呈正相關(guān)，HBeAg陽(yáng)性的HBV感染者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯高于HBeAg陰性者，可能的原因是HBeAg的存在更容易激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)，以達(dá)到免疫抑制的目的，免疫抑制效應(yīng)又促進(jìn)了病毒的復(fù)制，在CHB的免疫耐受中起一定的作用。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324-329.

[2]HUI CK，LAU GK.Immune system and hepatitis B virus infection[J].J Clin Virol，2005，34（Suppl 1）：44-48.

[3]FRANZESE O，KENNEDY PT，GEHRING AJ，et al.Modulation of the CD8+-T-cell response by CD4+CD25+regulatory T cells in patients with hepatitis B virus infection[J].J Virol，2005，79（6）：3322-3328.

[4]STOOP JN，VAN DER MOLEN RG，BAAN CC，et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].Hepatology，2005，41（4）：771-778.

[5]PENG G，LI S，WU W，et al.Circulating CD4+CD25+regulatory T cells correlate with chronic hepatitis B infection[J].Immunology，2008，123（1）：57-65.

[6]YANG Z，WANG S，ZHANG J，et al.Expression of PD-1 is up-regulated in CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cell of non-responders after hepatitis B surface antigen vaccine immunization[J].Clin Immunol，2008，129（1）：176-177.

[7]FRANCESCHINI D，PAROLI M，F(xiàn)RANCAVILLA V，et al.PD-L1 negativelyregulates CD4+CD25+Foxp3+Tregs by limiting STAT-5 phosphorylation in patients chronically infected with HCV[J].J Clin Invest，2009，119（3）：551-564.

[8]WANG F，WAN L，ZHANG C，et al.Tim-3-Galectin-9 pathwayinvolvesthesuppression induced byCD4+CD25+regulatory T cells[J].Immunobiology，2009，214（5）：342-349.

[9]XU D，F(xiàn)U J，JIN L，et al.Circulating and liver resident CD4+CD25+regulatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease progression in patients with hepatitis B [J].J Immunol，2006，177（1）：739-747.

[10]沈俊輝，李寧，范學(xué)工.慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞的檢測(cè)及意義 [J].世界華人消化雜志，2007，15（26）：2790-2795.