殷曉燕，何彥

（湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，湖南長沙410082）

0 引言

隨著科學(xué)技術(shù)的突飛猛進，材料科學(xué)在人們生產(chǎn)、生活的各個領(lǐng)域中起著越來越重要的作用，一直是人類社會技術(shù)進步，社會發(fā)展的基礎(chǔ)。所謂納米材料是指三維空間尺度至少有一維處于納米量級（1～100 nm）的材料，它是由尺寸介于原子、分子和宏觀體系之間的納米粒子所組成的新一代材料[1]，具有比表面積大、表面結(jié)合能極強[2]等特點，導(dǎo)致了它具有傳統(tǒng)固體材料所不具有的許多特殊性能，如高硬度、高強度、高韌性、高表面活性等等。因此，納米材料在國防、電子、化工、核技術(shù)、航空、冶金、輕工、醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價值，故近年來這一領(lǐng)域形成了新的交叉學(xué)科研究熱點。

納米膜是薄膜科學(xué)的重要研究內(nèi)容[3～4]，也是物理學(xué)、電子學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等多學(xué)科交叉滲透的研究領(lǐng)域。微電子學(xué)、催化化學(xué)、仿生電子學(xué)、光學(xué)、電學(xué)等的發(fā)展需要在納米尺度上對功能薄膜進行構(gòu)筑，實現(xiàn)納米器件、納米催化、分子開關(guān)及膜傳感器等的實際應(yīng)用。生物分子在固體表面的物理特性和力學(xué)行為，以及生物分子對被吸附表面的物理、力學(xué)特性的影響越來越受到研究者們的關(guān)注，尤其是在分子電子器件、生物分子識別、生物粘附以及自組裝、納米潤濕、金屬防腐等領(lǐng)域，都是令人感興趣的課題。生物分子在固體表面的吸附行為在納米技術(shù)領(lǐng)域扮演著重要的角色。

納米SiO2作為納米材料中的重要組成部分,是一種無毒、無味、無污染的非金屬材料。對電子封裝材料、高分子復(fù)合材料、陶瓷、橡膠、塑料、玻璃鋼、粘結(jié)劑、密封膠、涂料等諸多行業(yè)產(chǎn)品的提高檔次、升級換代帶來劃時代的意義，SiO2納米粒子具有很強的應(yīng)用前景。而SiO2納米薄膜優(yōu)越的電絕緣性和工藝的可行性，使之在微電子工藝中具有獨特優(yōu)勢。另外，SiO2納米薄膜可用于制備光學(xué)增透膜[5]、傳感器敏感薄膜[6]等領(lǐng)域。既然SiO2納米薄膜有如此重要的作用，因此，很有必要從單分子水平上研究SiO2納米薄膜的表面性質(zhì)。

采用了溶膠-凝膠的方法合成了200 nm的SiO2粒子[7]，并在潔凈的蓋玻片表面經(jīng)旋轉(zhuǎn)成膜法形成薄膜。應(yīng)用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microsocpe,TIRFM）和微分干涉顯微鏡（Differential Interference Contrast Microscope，DIC），以YOYO-1標(biāo)記的λ-DNA分子為探針，研究了單個DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的行為，并在不同的pH值下，考察了pH值對單個DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面行為（DNA自由運動和吸附）的影響，并用接觸角（CA）和原子顯微鏡（AFM）表征了SiO2納米粒子薄膜的表面性質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

濃硫酸（98%）、雙氧水、醋酸、醋酸鈉、氯化鈉、氨水（25%）、無水乙醇和正硅酸四乙酯（Tetraethyl orthosilicate，TEOS）為上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，甘氨酸（Gly）為Sigma（Svt.Louis，USA）產(chǎn)品，λ-DNA（48,502 bp）購于美國的Promega公司，嵌入式染料YOYO-1購于美國的Molecular Probe公司。所用水均為二次蒸餾水。

緩沖液：不同pH的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH為4.02，4.42，4.96，5.43，5.96，6.41，6.78，8.20）的離子強度均為25 mmol/L。

SB3200DT超聲波清洗機購于寧波新芝生物科技股份有限公司，均膠機購于上海凱美特功能陶瓷技術(shù)有限公司，循環(huán)水式多用真空泵為鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品，接觸角測量儀（JC2000C）購于上海中晨數(shù)字儀器有限公司。所有的原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）實驗均使用多模AFM（SPI3800N-SPA，400，Seiko Instrument）儀器，操作模式為敲擊模式，掃描速率為1.00 Hz。

TIRFM是日本尼康公司生產(chǎn)的ECLIPSE TE2000-U倒置顯微鏡，物鏡為60×PlanApo/TIRFM（oil 1.45 NA），油（n=1.515）同為日本尼康公司產(chǎn)品。激發(fā)光源為氬離子激光器（488 nm/514 nm），購于上海埃奧激光設(shè)備有限公司。所用的相機為CoolSnap HQ2 CCD（Roper Scientific Inc.），像素是1392×1040，曝光時間是100 ms。圖像由MetaVue（Roper Scientific Inc.）軟件所得，所有圖像均由Image J（1.37 V，NIH）進行處理。

1.2 DNA樣品的制備

λ-DNA與YOYO-1染料按每5個堿基對（bp）1個YOYO-1的比例制備DNA樣品。熒光染料YOYO-1的結(jié)構(gòu)式如圖1[8]所示，YOYO-1是一個同型二聚體，它以插入的方式與DNA結(jié)合[8]。當(dāng)YOYO-1與DNA分子結(jié)合時因其較大的吸光系數(shù)和高熒光量子產(chǎn)率而被廣泛應(yīng)用于DNA的檢測與分離[8～9]，尤其在水溶液中YOYO-1與DNA的結(jié)合體比較穩(wěn)定，便于實驗的實施[10]，因此常用于標(biāo)記DNA分子。DNA樣品制備溶液為pH8.20的10 mmol/L Gly-Gly緩沖液，母液濃度是200 pmol/L，在進行單分子熒光檢測實驗前，所有的溶液進一步稀釋至10 pmol/L。

1.3 SiO2納米粒子薄膜的制備

1.3.1 200 nm SiO2納米粒子的合成[7]

圖1 染料YOYO-1的結(jié)構(gòu)示意圖[8]Fig.1 Structural diagram of YOYO-1

將20 mL無水乙醇注入到潔凈的三頸燒瓶中，分別加入1.59 mL 25%的氨水和1.63 mL二次蒸餾水，此溶液為A溶液。將1.5 mL正硅酸四乙酯溶于5.3 mL無水乙醇中，混合均勻，此為B溶液。在攪拌A溶液的同時迅速將B溶液傾入A溶液中，在室溫下反應(yīng)約15 h，并不斷攪拌。

1.3.2 SiO2納米粒子薄膜的制備

蓋玻片用Piranha溶液（V(H2SO4)∶V(H2O2)=7∶3)浸泡6～7 h，用二次水超聲1 h后，吹干備用。

將40 μL的SiO2溶液滴加在用Piranha溶液清洗好的蓋玻片（Erie Scientific，USA）表面，經(jīng)均膠機旋轉(zhuǎn)在蓋玻片表面形成單層膜，其旋轉(zhuǎn)時參數(shù)如下：300 r/s，6 s；1 500 r/s，6 s。一部分樣品直接進行單分子實驗，另一部分則在烘箱中干燥7～8 h（70℃）后進行單分子實驗。實驗中未干燥的SiO2納米粒子薄膜是指未經(jīng)過7～8 h（70℃）處理。

1.4 單分子熒光成像實驗

單分子實驗中，先將表面經(jīng)均膠機旋轉(zhuǎn)形成SiO2納米粒子薄膜的蓋玻片置于顯微鏡的載物臺上，先用DIC模式觀察SiO2納米粒子薄膜的表面形貌并拍照，在保持單層膜在載物臺上位置不變的情況下，將5 μL DNA樣品滴于蓋玻片上，再將另一片未經(jīng)過修飾且干凈的蓋玻片蓋在上面，用TIRFM模式觀察單個DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的行為。為了確保實驗結(jié)果的可靠性，經(jīng)過烘干和未烘干的SiO2納米粒子薄膜需同時進行單分子實驗。

1.5 接觸角（CA）表征

SiO2納米粒子薄膜表面的接觸角（CA）測量采用接觸角測量儀（JC2000C）進行測量。取3 μL二次水滴在SiO2納米粒子薄膜上，為確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性，滴5個不同的部位，同時測量5次取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 SiO2納米粒子的表征

如圖2所示，合成的SiO2納米粒子具有良好的單分散性，且80%以上的SiO2納米粒子的粒徑在200～240 nm左右。

2.2 SiO2納米粒子薄膜的AFM和CA表征

應(yīng)用CA值的測量和AFM宏觀地表征了烘干的SiO2納米粒子薄膜表面的親水性和表面形貌。表1給出了經(jīng)過烘干的SiO2納米粒子薄膜表面的接觸角為(23.95±2.18)°，說明該表面是超親水表面，但是與用Piranha洗液清洗的蓋玻片的接觸角相比要略微大些，說明烘干的SiO2納米粒子薄膜表面疏水性比潔凈的蓋玻片表面稍強。SiO2納米粒子薄膜表面形貌如圖3所示，可知蓋玻片表面經(jīng)均膠機旋轉(zhuǎn)形成SiO2納米粒子薄膜相對比較均勻，但個別地方仍有缺陷。

表1 烘干的SiO2納米粒子薄膜表面的CA值Tab.1 CA values of dry SiO2Nanoparticle film surface

圖2 SiO2納米粒子的TEM圖（A）和粒徑分布圖（B）Fig.2 TEM image(A)and diameter distribution(B)of SiO2nanoparticles

圖3 SiO2納米粒子薄膜表面的AFM圖Fig.3 AFM images of SiO2nanoparticle film surface

2.3 單分子熒光成像

通過DIC模式，在顯微鏡下可以看到SiO2納米粒子薄膜的粗略形貌，圖4 A-1和B-1分別是烘干和未烘干的SiO2納米粒子薄膜利用DIC模式拍攝的照片，由圖可知，經(jīng)均膠機旋轉(zhuǎn)形成SiO2納米粒子薄膜并非完全鋪滿整個蓋玻片表面，蓋玻片的有些區(qū)域仍然是裸露的玻璃，說明這個薄膜是不完美的，即使薄膜表面仍是有缺陷，這與AFM結(jié)果是一致的。為了鑒別DNA的吸附是傾向于蓋玻片還是SiO2納米粒子薄膜，或者是更容易吸附在SiO2納米粒子薄膜的缺陷中，單分子實驗首先選擇了一部分為裸露的蓋玻片，另一部分為SiO2納米粒子薄膜的區(qū)域以及含有SiO2納米粒子薄膜缺陷的區(qū)域（圖4A-1和B-1），在不同的pH值下對DNA進行成像實驗，圖4給出了在pH=4.96時的成像情況。由圖4的A-2，A-3和B-2，B-3中可明顯看出，無論SiO2納米粒子薄膜烘干與否，DNA分子大部分都傾向于吸附在SiO2納米粒子薄膜表面，但是個別分子也吸附在裸露的蓋玻片表面或者SiO2納米粒子薄膜的缺陷區(qū)域，因為在pH=4.96時，仍有個別DNA分子自由運動，當(dāng)其運動至裸露的蓋玻片表面或者SiO2納米粒子薄膜的缺陷區(qū)域時造成吸附。由此證明，SiO2納米粒子薄膜的個別缺陷或者不完美的情況并不影響整個單分子實驗的準(zhǔn)確性，數(shù)據(jù)是可信的。

為了進一步驗證SiO2納米粒子薄膜的不完美是否影響實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確及可靠性，對于烘干的SiO2納米粒子薄膜表面，分別計算了DNA分子在其表面成像的整個區(qū)域（1392×1040像素）和截取的相對來說比較完美的全部都是SiO2納米粒子薄膜的小區(qū)域（496×449像素）的吸附百分率。圖5是DNA在烘干和未烘干的SiO2納米粒子薄膜表面吸附百分率pH8.20～pH4.02值的變化曲線，由結(jié)果可知，無論是大區(qū)域還是小區(qū)域，其結(jié)果相似，由此也可證明SiO2納米粒子薄膜的個別缺陷或者不完美的情況并不影響整個單分子實驗的準(zhǔn)確性。在pH=8.20時，DNA分子全部都是自由運動的，隨著pH的降低，DNA分子開始在SiO2納米粒子薄膜表面吸附，且其吸附百分率隨著pH值的降低而逐漸增加。DNA的等電點是4～4.5，隨著溶液pH值的降低，越來越接近其等電點，DNA表面所帶的負(fù)電荷就越來越少。而在接近SiO2的pKa值（3）時，SiO2納米粒子薄膜表面的硅烷醇就會發(fā)生質(zhì)子化作用，使其表面成中性，此時SiO2納米粒子薄膜表面與DNA之間的靜電排斥力也就隨之降低，這就有利于DNA分子在其表面的吸附。

圖4 pH為4.96時，DNA單分子行為的成像照片，像素均為1392×1040（A-1）,（A-2）,（A-3）分別為烘干的SiO2納米粒子薄膜基底的DIC照片，DNA在烘干的SiO2納米粒子薄膜表面的TIRFM和DIC-TIRFM照片。（B-1）,（B-2）,（B-3）分別為未烘干的SiO2納米粒子薄膜基底的微分干涉相差顯微鏡照片，DNA在未烘干的SiO2納米粒子薄膜表面的TIRFM和DIC-TIRFM照片F(xiàn)ig.4 DIC image(1),TIRFM image(2)and DIC-TIRFM image(3)of single DNA molecular behavior on the dried(A)and not dried(B)surface of SiO2nanoparticle film at pH4.96.Image sizes are 1392×1040 pixels

圖5 DNA在SiO2納米粒子薄膜表面吸附量隨pH的變化Fig.5 Fraction absorption of single DNA molecules at the SiO2nanoparticle film surface as a function of pH

另外，由圖5可知，在相同的pH值下，DNA分子在烘干和未烘干的SiO2納米粒子薄膜表面的吸附百分率是有差別的，后者的DNA吸附百分率略大一點。由于未烘干的SiO2納米粒子薄膜表面含有一層很薄的水分子層，在低pH下，有利于SiO2納米粒子薄膜表面的硅烷醇發(fā)生質(zhì)子化，使其表面與DNA分子的經(jīng)典排斥力更小。對于烘干SiO2納米膜，從pH8.20到pH4.96，隨著pH值的降低吸附率逐漸增加，但是其幅度較小，而當(dāng)pH值為5.43時，吸附率迅速增大，而從pH5.43開始至pH4.02也是隨著pH的降低吸附率逐漸增加，直至完全吸附，其幅度則很大。未烘干SiO2納米粒子薄膜，其情況類似。

圖6 不同pH值下DNA在烘干的SiO2納米粒子薄膜表面的熒光照片（像素均為496×449（53.22 μm×48.27 μm））（A）為烘干的SiO2納米粒子薄膜的DIC照片，（B）pH5.96，（C）pH5.43，（D）pH4.96，（E）pH4.42，（F）pH 4.02Fig.6 DIC image(A)and fluorescence images of single DNA molecules on the dried SiO2nanoparticle film surface at pH=5.96(B),5.43(C),4.96(D),4.42(E),4.02(F)

圖6給出了DNA分子在不同pH值下，在烘干的SiO2納米粒子薄膜表面行為的熒光照片，圖A是截取的相對來說比較完美的全部都是SiO2納米粒子薄膜的小區(qū)域（496×449像素）部分。通過照片可知，當(dāng)pH=5.96時，少數(shù)DNA分子開始逐漸吸附在SiO2納米粒子薄膜表面上，且可看到一端吸附，另一端則運動的現(xiàn)象（圖6B），但是絕大部分的DNA分子仍然是自由運動的。在pH=5.43時，DNA的吸附百分率增加，并且可以看到DNA分子以短棒的形式吸附在其表面（圖6C）。當(dāng)pH降到4.96時，絕大部分的DNA分子已經(jīng)吸附在SiO2納米粒子薄膜表面，不僅有呈短棒狀態(tài)的DNA分子，還可以看到個別的DNA分子已呈拉伸狀態(tài)（圖6D）。在進行單分子實驗的過程中，通過顯微鏡可以看到DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附并不是瞬間完成的，DNA分子的一端先吸附在SiO2納米粒子薄膜表面，而另一端仍可以運動，隨著溶液流動的方向，DNA分子的中部開始吸附在SiO2納米粒子薄膜表面，最后DNA分子的另一端也吸附在SiO2納米粒子薄膜表面，導(dǎo)致了DNA分子完全拉伸的狀態(tài)，也完成了其在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附過程。根據(jù)先前文獻的研究，DNA分子末端存在著12個未配對的堿基，該區(qū)域有較強的疏水性質(zhì)，因此，DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附行為可歸結(jié)為靜電作用和疏水作用的雙重作用，但是起主導(dǎo)作用的是疏水作用。在pH=4.42時，DNA分子已經(jīng)完全吸附在SiO2納米粒子薄膜表面，且吸附的DNA分子總數(shù)明顯增加，呈現(xiàn)短棒和完全拉伸的DNA分子個數(shù)也增加（圖6E）。而當(dāng)pH進一步降到4.02時，DNA分子則快速的完全吸附在SiO2納米粒子薄膜表面，且呈現(xiàn)更多已經(jīng)完全拉伸的DNA分子（圖6F）。

無論是在烘干還是未烘干的SiO2納米粒子薄膜表面，DNA分子的吸附百分率都要比在蓋玻片表面的吸附百分率大得多（表2），這主要是由于以下幾點原因引起的：第一，SiO2納米粒子的比表面積大，在相同條件下，接觸DNA的機會就大得多；第二，SiO2納米粒子薄膜的表面活性（硅烷醇的數(shù)量）要比蓋玻片大得多；第三，SiO2納米粒子薄膜表面的疏水性比蓋玻片強些（表2）。

表2 不同pH值下DNA在不同表面的吸附百分率Tab.2 Percentage adsorption of DNA molecules on various surfaces at different pH

3 結(jié)論

應(yīng)用TIRFM和DIC模式，以YOYO-1標(biāo)記的DNA分子作為探針，在不同的pH值下，從單分子水平上研究了DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的行為，并采用宏觀的方法，即接觸角和AFM表征了SiO2納米粒子薄膜表面的性質(zhì)。單分子實驗表明，在pH=8.20時，DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面全部都是自由運動的，隨著pH的降低，DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附百分率逐漸增加，直至完全吸附，并呈現(xiàn)拉伸的狀態(tài)。DNA在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附行為歸結(jié)為疏水作用和靜電引力的雙重作用結(jié)果，但是起主導(dǎo)作用的則是疏水作用。此外，DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附百分率比文獻報道的在蓋玻片表面的吸附百分率要大得多，這是由于SiO2納米粒子的比表面積大，表面活性位點多，且疏水性能強的緣故。

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