豆豉水提物對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性影響

陳 靜，李里特

(1.北京物資學(xué)院物流學(xué)院，北京 101149；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

豆豉水提物對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性影響

陳 靜1，李里特2

(1.北京物資學(xué)院物流學(xué)院，北京 101149；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

本研究收集全國各地的37種豆豉樣品，測試其水提物對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性。結(jié)果表明：37種來源不同的豆豉樣品水提物均對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)一定程度的抑制活性，其中5#(L.Y)、16# (W.N.H)以及21#(M.W)豆豉水提物對α-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)較高的抑制活性(P＜0.05)；此外，通過對高活性豆豉的蔗糖和葡萄糖含量檢測，結(jié)果表明，盡管豆豉中含有微量的葡萄糖，但抑制干擾作用甚微。本研究結(jié)果預(yù)示著豆豉中存在可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，這種活性成分呈現(xiàn)較好的水溶性，可能是具有類似糖結(jié)構(gòu)的成分在起作用，有待于深入研究。

豆豉；水提物；α-葡萄糖苷酶抑制；活性成分

現(xiàn)代研究表明，發(fā)酵大豆制品中有著豐富的生物活性物質(zhì)，各種生物活性物質(zhì)各自或相互協(xié)同作用，構(gòu)成了大豆發(fā)酵食品獨特的生理功能，如抗過敏、抗癌、溶血栓、抗氧化[1]、降血壓[2-3]和抗菌等[4]。但是針對發(fā)酵大豆食品的降血糖活性研究的相關(guān)報道所見甚少。Fujita等[5]發(fā)現(xiàn)讓邊緣糖尿病人和癥狀較輕的糖尿病人每天服用0.9g豆豉提取物，連續(xù)服用6個月，平均血糖值由(9.31±0.070)mmol/L降低到(8.61±0.66)mmol/L，且無一例副作用出現(xiàn)；隨后2005年他們后續(xù)研究報道了豆豉水提物對血脂的影響，讓非糖尿病人和小鼠每頓餐前食入0.3g豆豉提取物，結(jié)果顯示在受試者體內(nèi)三酸甘油酯水平明顯降低，因此也確定了豆豉可長期用來治療糖尿病[6]，但并未對其中降血糖成分進(jìn)行分析、鑒定。我國作為豆豉生產(chǎn)的起源國，有著十分寶貴、分布廣泛的豆豉資源，然而在這方面的研究開展較少。

本實驗中收集了來源于全國各地的37種豆豉樣品，其中南方地區(qū)的樣品分別來源于兩廣及云南地區(qū)；中部地區(qū)的樣品主要采集于湖南、江西及重慶等地；中西部則主要采樣于四川盆地一帶，四川是我國豆豉食用最為廣泛的地區(qū)；北部地區(qū)樣品主要來源東北及陜西一帶。這些豆豉樣品幾乎遍布了中國各地，因此在一定程度上可以代表中國的傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉。從這些豆豉中提取降血糖活性成分，進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評價，深入分析豆豉α-葡萄糖苷酶抑制活性與內(nèi)在成分之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗中所用樣品均購買于全國各地不同地區(qū)的超市、農(nóng)貿(mào)市場，其中一些自制樣品是采樣于當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶家中，豆豉樣品具體品牌、產(chǎn)地及感官狀態(tài)見表1。

4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside)、小鼠腸道丙酮提取粉(intestinal acetone powders of rat) 美國Sigma 公司；蔗糖、葡萄糖測定試劑盒(10 139 041 035) 美國Roche公司；以上均為分析純。

FDU-540真空冷凍干燥機(jī) 日本東京理化公司；Model 550酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司日本東京實驗室；FW 177中草藥粉碎機(jī) 中國天津泰斯特儀器有限公司；TS5BS4高速均質(zhì)機(jī) 德國IKA labortechnik公司；MS-8496F 96微孔板(0.4mL×96) 日本住友電木有限公司；Millx-HV微孔過濾器 日本Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 豆豉樣品水提物的制備

取各種市售豆豉樣品置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，在中草藥粉碎機(jī)中磨成粉末狀，粒度大于6目，然后精確稱取豆豉凍干粉1.000g，置于50.0mL離心管中，加入10.0mL蒸餾水溶解，在均質(zhì)機(jī)中高速均質(zhì)(20000r/min，5min)，然后使用超聲波提取(100W，30min)，取出離心(3700r/min，10min)，取其上清液使用0.45μm 微孔過濾膜過濾，收集過濾液即得豆豉水提物。

1.2.2 豆豉樣品水提物α-葡萄糖苷酶抑制實驗

本研究中所使用的α-葡萄糖苷酶體外抑制實驗方法是本課題組針對豆豉樣品顏色較深的特殊性，參考傳統(tǒng)方法并進(jìn)行部分改進(jìn)[7]，與傳統(tǒng)實驗方法相比，此法更適合于一些深顏色樣品的活性檢測。

磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)：稱取NaH2PO4· 2H2O 3.365g，Na2HPO4·12H2O 10.182g，定容到1000mL，調(diào)節(jié)pH6.7，儲存在4℃冰箱。

底物：4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)，質(zhì)量濃度0.9133mg/mL，溶解于磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)中，漩渦混合均勻。

α-葡萄糖苷酶：小鼠丙酮提取物配成質(zhì)量濃度為25mg/mL，溶解于磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)中，漩渦混合均勻，高速離心(9000r/min，15min)，取其上清液待用。

終止液：Na2CO3，71.389mg/mL，溶解在蒸餾水中。

將豆豉水提物在96孔板中加入蒸餾水倍比稀釋，稀釋到2、4、8、16、32、64、128倍，準(zhǔn)備待測。首先在96孔酶標(biāo)板內(nèi)加入120μL的磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH 6.7)，然后加入20μL樣品，在陽性和陰性對照孔里以20μL磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)代替。然后在樣品孔和陽性對照孔里加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液，在樣品對照孔和陰性孔中加入50μL磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)代替，在微孔板振蕩器上混合均勻。最后在所有的微孔中注入50μL的4-NPG溶液，再次振蕩混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱保溫40～50min。最終

以50μL的Na2CO3溶液的加入終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在405nm波長處測定吸光度。最終以樣品的梯度質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制回歸直線，求其斜率Ki值，Ki值越大，表示樣品抑制活性越強(qiáng)。

表1 豆豉、大醬樣品名稱、產(chǎn)地及感官特性Table 1 Production origins, names and sensory properties of Douchi and miso samples

1.2.3 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖含量的測定

使用蔗糖和D-葡萄糖紫外檢測試劑盒檢測豆豉中的蔗糖和葡萄糖。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析，使用S-N-K檢驗方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析檢驗，在P＜0.05水平數(shù)據(jù)之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆豉水提物對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響

圖1 各種市售豆豉水提物對α- 葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.1 Anti-α- glucosidase activity of water-extract from vraious commmercial Douchi samples

全國各種市售豆豉樣品水提物的α-葡萄糖苷酶抑制實驗結(jié)果如圖1所示。通過對收集到的37種來源不同的豆豉樣品進(jìn)行體外抑制實驗，結(jié)果顯示我國大部分豆豉樣品水提物均對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)一定程度的抑制活性。根據(jù)α-葡萄糖苷酶體外抑制實驗方法分析，所得到的抑制斜率值(Ki)越高，表明樣品的抑制活性越強(qiáng)。因此縱觀各種豆豉樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性圖可以看出，我國傳統(tǒng)發(fā)酵所制的豆豉對α-葡萄糖苷酶的確存在著抑制作用。

SPSS統(tǒng)計結(jié)果顯示5#(L.Y)、16#(W.N.H)以及21# (M.W)豆豉樣品的水提物對α-葡萄糖苷酶具有較高的酶抑制活性，其抑制斜率值(Ki)顯著高于其他樣品(P＜0.05)，其他品牌的豆豉樣品呈現(xiàn)一個相對次低或較低的抑制活性。就豆豉生產(chǎn)的區(qū)域角度分析，3種具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的豆豉來源產(chǎn)地不同，5#(L.Y)豆豉來源于湖南瀏陽地區(qū)，16#(W.N.H)豆豉來源于四川地區(qū)，而21#(M.W)豆豉則源產(chǎn)于江西。豆豉在我國的南方以及中部地區(qū)食用廣泛，且生產(chǎn)廠家較多，并且許多農(nóng)戶自己制作豆豉食用，因此在加工工藝上存在著一定的差異以及不穩(wěn)定性。此外從豆豉樣品中微生物的角度而言，5#(L.Y)豆豉源自湖南地區(qū)，而這一地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉主要以曲霉型為主，16#(W.N.H)豆豉和21#(M.W)豆豉則均為毛霉型豆豉，因此就本實驗篩選到的3種高活性的豆豉樣品而言，其體外抑制活性強(qiáng)弱并不是關(guān)鍵取決于某種或某類微生物的存在與否；另外從感官角度分析，針對豆豉樣品的顏色而言，5#(L.Y)豆豉、16# (W.N.H)豆豉樣品的外觀顏色為黑色，21#(M.W)豆豉樣品的顏色為棕黃色，表明豆豉顏色深淺與其α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)弱無直接關(guān)系。但是不同的豆豉樣品又的確存在著α-葡萄糖苷酶抑制能力的差異，那么差異產(chǎn)生的原因可能在于豆豉樣品生產(chǎn)廠家的加工工藝的區(qū)別，因此發(fā)酵溫度、大豆品種、蒸煮條件、處理工藝以及發(fā)酵時間等工藝條件的不同都有可能是導(dǎo)致豆豉樣品α-葡萄糖苷酶抑制活性不同的因素。

綜上所述，盡管由于不同豆豉樣品的加工工藝不同而導(dǎo)致了豆豉樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性的強(qiáng)弱不同，但可以明確的是我國傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉樣品的確具有顯著抑制小鼠腸道內(nèi)α-葡萄糖苷酶的作用，預(yù)示著我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉具有潛在的降血糖活性。

2.2 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖的含量

表2 豆豉中蔗糖和葡萄糖的含量Table 2 Contents of sucrose and glucose in Douchi samples g/100g

豆豉水提物中葡萄糖和蔗糖含量檢測如表2所示。由于在α-葡萄糖苷酶體外抑制實驗中，蔗糖和葡萄糖會產(chǎn)生一定的干擾作用，使得所測定的結(jié)果偏高；同時豆豉作為潛在降糖食品，對明確其中葡萄糖以及蔗糖的含量也是十分必要的。實驗結(jié)果表明，部分豆豉樣品中的確含有一定量的葡萄糖和蔗糖，含量維持在1.88%以下。對于篩選得到3種具有高抑制活性的豆豉樣品(5#、16#和21#)，在實驗的檢測范圍內(nèi)并沒有檢測到

蔗糖的存在，但有微量的葡萄糖存在，16#(W.N.H)樣品中含有1.88%的葡萄糖，21#(M.W)豆豉中含有0.153%的葡萄糖，而5#(L.Y)未檢到葡萄糖。與此同時配制相同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測其體外α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果顯示其抑制活性僅在5%～8%，而豆豉樣品水提物的抑制活性可以達(dá)到60%左右。因此本實驗結(jié)果表明盡管豆豉中有微量的葡萄糖存在，但所起的抑制作用甚微，因此對豆豉樣品抑制活性檢測結(jié)果影響不大，同時也預(yù)示著豆豉中還存在著其他可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，這種成分呈現(xiàn)較強(qiáng)的水溶性，而且可能具有類似糖結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

37種來源不同的豆豉樣品的水提物均對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶均呈現(xiàn)一定程度的抑制活性，其中5# (L.Y)、16#(W.N.H)以及21#(M.W)水提物對α-葡萄糖苷酶具有較高的酶抑制活性(P＜0.05)；通過對高活性豆豉的蔗糖和葡萄糖的檢測，結(jié)果表明盡管豆豉中含有微量的葡萄糖，但抑制干擾作用甚微；通過本實驗的研究預(yù)示著豆豉中存在可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，這種活性成分呈現(xiàn)較好的水溶性，可能是具有類似糖結(jié)構(gòu)的成分在起作用，有待于繼續(xù)深入研究。

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in vitro Inhibitory Effect of Water Extract from Douchi on Alpha-glucosidase Activity

CHEN Jing1，LI Li-te2
(1. Logistics School, Beijing Wuzi University, Beijing 101149, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Thirty-seven Douchi samples collected from various regions of China were tested for the inhibitory effects of their water extracts on alpha-glucosidase in vitro. The water extracts from all these Douchi samples could inhibit mouse intestinal alpha-glucosidase to a certainty extent. In addition, samples NO.5 (L.Y), NO.16 (W.N.H) and NO.21 (M.W) showed stronger inhibitory effect against the enzyme (P ＜ 0.05). Moreover, microamounts of glucose existing in Douchi samples had less interrupting effect on the anti-hyperglycemic activity of Douchi water extract. This study suggests that there are some active components in Douchi, which can strongly inhibit alpha-glucosidase and present excellent water solubility. These components may have sacchride-like structures. However, this needs to be deeply investigated.

Douchi；water extract；alpha-glucosidase；active components

TS214.9

A

1002-6630(2010)17-0064-04

2010-01-07

陳靜(1978—)，女，講師，博士，研究方向為食品科學(xué)及生物技術(shù)。E-mail：chenjingsusan@126.com