高效液相色譜法測定果蔬中7種植物激素的殘留量

周艷明，忻 雪

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，遼寧 沈陽 110866)

高效液相色譜法測定果蔬中7種植物激素的殘留量

周艷明，忻 雪

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，遼寧 沈陽 110866)

建立高效液相色譜法測定果蔬中7種植物激素殘留的方法。選擇10種果蔬樣品，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)80%甲醇提取后、過C18柱凈化，用帶有紫外檢測器的液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。通過對(duì)該方法的精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，所有激素的添加回收率均在70.23%～98.10%之間，回收率的變異系數(shù)在3.34%～10.12%之間，方法的最低檢出限為0.004～0.02mg/kg、最低定量限為0.01～0.1mg/kg，所建立的果蔬中植物激素殘留量的測定方法滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中農(nóng)藥殘留測定的要求，可提供給相關(guān)部門用于對(duì)相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品、食品的質(zhì)量監(jiān)控。

高效液相色譜法；果蔬；植物激素

植物激素是植物體內(nèi)合成的對(duì)植物生長發(fā)育有顯著作用的集中微量有機(jī)物質(zhì)，其生理效應(yīng)非常復(fù)雜、多樣。植物激素影響細(xì)胞的分裂、伸長、分化及植物發(fā)芽、生根、開花、結(jié)實(shí)、性別的決定、休眠和脫落等[1-2]，所以植物激素對(duì)植物的生長發(fā)育有重要調(diào)節(jié)控制作用。

在進(jìn)行高效液相色譜法測定時(shí)選擇合適的植物激素提取純化方法和色譜條件極為重要。如果提取純化方法不當(dāng)，樣品中含有的雜質(zhì)較多，將難以對(duì)目的組分進(jìn)行有效分離，不能達(dá)到檢測目的[3-4]；如果沒有合適的色譜條件，測定時(shí)會(huì)出現(xiàn)分離差、峰型不良及嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象。目前，大多液相色譜法只能同時(shí)測定3～5種植物激素。本方法旨在建立高效液相色譜法同時(shí)分離測定果蔬中7種植物激素含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄、黃瓜、辣椒、蘿卜、茄子、葡萄、蘋果、桃子、梨、西瓜 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果園。

甲醇、乙酸乙酯(純度大于99%) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水甲酸(純度大于99%) 沈陽化學(xué)試劑廠；甲醇(色譜純)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZTK)、萘乙酸(NAA)、脫落酸(ABA)、吲哚丁酸(IBA)、烯效唑(Uniconazole)、調(diào)吡脲(Forchlorfenuron)(純度均大于99%) Dikma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀(配有DAD紫外檢測器) 美國Agilent公司；C18固相萃取柱 Waters公司；C18色譜柱(250mm×46mm，5μm) Dikma公司；1602電子分析天平(萬分之一精度) 德國Satorius公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(250mm×46mm，5μm)；流動(dòng)相：A：0.2%甲酸，B：甲醇；柱溫：35℃；進(jìn)樣量20μL。

1.3.2 樣品處理

提?。悍Q取切碎后的樣品5g放入稱量瓶中，加入10mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇提取劑，超聲振蕩15min，抽濾，用2×5mL的提取劑洗滌殘?jiān)?，抽濾，合并3次濾液，倒入雞心瓶中，用少量的甲醇沖洗布什漏斗內(nèi)壁，由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(40℃)濃縮至水相[5]。

凈化：將濃縮后的水相調(diào)pH7.0，用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取(3×5mL)，揮干乙酸乙酯，用5%甲醇1mL定容，過SPE-PAK C18固相萃取小柱，用4mL 40%甲醇溶液洗脫，收集上樣液和洗脫液(共5mL)，過0.45μm濾膜，即為待測液[6-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

以甲醇-水溶液作為流動(dòng)相7種激素不能完全分開，而且色譜峰拖尾嚴(yán)重，峰形較差。甲酸可以抑制樣品的電離，改善拖尾現(xiàn)象，因此在流動(dòng)相中加入甲酸。在甲醇-水溶液中分別加入體積分?jǐn)?shù)為1%、0.5%和0.2%的甲酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度1μg/mL，結(jié)果見圖1。

圖1 不同流動(dòng)相7種植物激素色譜圖Fig.1 Chromatograms of 7 kinds of plant hormone using a 1%, 0.5% and 0.2% formic acid solution/methanol mixture as the mobile phase

由圖1可知，當(dāng)加入甲酸體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，部分峰重疊，沒有完全分開；當(dāng)加入甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，激素峰有拖尾現(xiàn)象；因此確定水相中的甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.2%，既能保證7種激素完全分開，又有效去除拖尾現(xiàn)象，使峰形最佳，并且可避免酸度過大損傷色譜柱填料。

2.1.2 梯度洗脫條件的確定

影響分離的最主要因素是梯度洗脫的選擇[12]，根據(jù)7種植物激素的性質(zhì)，分別對(duì)以下3種洗脫條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，洗脫條件見表1，色譜圖見圖2。

表1 不同梯度洗脫條件的選擇Table 1 Screening of gradient elution program

由圖2可見，條件1中吲哚乙酸和脫落酸的色譜峰不能完全分開且α-萘乙酸的峰形不佳；條件3中吲哚丁酸和α-萘乙酸的色譜峰相隔較近且脫落酸稍有拖尾現(xiàn)象；相比之下條件2時(shí)，7種植物激素不但能夠得到較好的分離，且保證了出峰時(shí)間和峰形都較為適宜，故選擇條件2的梯度洗脫。

圖2 不同梯度洗脫條件7種植物激素的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 7 kinds of plant hormone under gradient elution protocol No. 1, No. 2 and No. 3

2.27 種植物激素的線性范圍

配制10、5、2、1、0.5、0.1μg/mL質(zhì)量濃度的7種植物激素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，得出其線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2，在0.5～10μg/mL線性關(guān)系良好。

表2 7種植物激素的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges, regression equations and correlation coefficients for the determination of 7 kinds of plant hormone

由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.5～10μg/mL之間，質(zhì)量濃度與其色譜響應(yīng)間呈線性，7種植物激素的線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.997，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.3 檢出限

在本實(shí)驗(yàn)選定的色譜條件下，黃瓜添加0.2mg/kg植物激素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖3。

式中：C為樣品添加水平0.2mg/kg；信噪比RSN分別為玉米素24.5、吲哚乙酸39.3、脫落酸169.2、吲哚丁酸30.3、α-萘乙酸22.4、調(diào)吡脲105.1、烯效唑88。

圖3 添加0.2mg/kg的黃瓜樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of cucumber sample with the addition of 0.2 mg/kg plant hormone

由式(1)計(jì)算得7種植物激素的最低檢出限分別為：玉米素0.02mg/kg、吲哚乙酸0.02mg/kg、脫落酸0.004mg/ kg、吲哚丁酸0.02mg/kg、α-萘乙酸0.02mg/kg、調(diào)吡脲0.006mg/kg、烯效唑0.007mg/kg。7種植物激素的最低檢出限范圍在0.004～0.02mg/kg之間。

式中：C為樣品添加水平0.2mg/kg；信噪比RSN分別為玉米素24.5、吲哚乙酸39.3、脫落酸169.2、吲哚丁酸30.3、α-萘乙酸22.4、調(diào)吡脲105.1、烯效唑88。

由式(2)計(jì)算得7種植物激素的最低定量限分別為玉米素0.1mg/kg、吲哚乙酸0.1mg/kg、脫落酸0.01mg/kg、吲哚丁酸0.1mg/kg、α-萘乙酸0.08mg/kg、調(diào)吡脲0.02mg/kg、烯效唑0.02mg/kg。7種植物激素的最低定量限范圍在0.01～0.1mg/kg之間。

2.4 精密度

以蘋果為例，在蘋果中添加3個(gè)水平的7種植物激素，測定的回收率和變異系數(shù)結(jié)果見表3。

表3 蘋果中7種植物激素加標(biāo)回收率及精密度(n=5)Table 3 Recovery and RSD of 7 plant hormones in apple (n=5)

由表3可見，所有激素的添加回收率均在70.23%～98.10%之間，回收率的變異系數(shù)在3.34%～10.12%之間，回收效果較好，精密度較高。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖譜表明該方法快速，靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確度高。7種植物激素的最低檢出限分別為：玉米素0.02mg/kg、吲哚乙酸0.02mg/kg、脫落酸0.004mg/kg、吲哚丁酸0.02mg/kg、α-萘乙酸0.02mg/ kg、調(diào)吡脲0.006mg/kg、烯效唑0.007mg/kg；所有激素的添加回收率均在70.23%～98.10%之間，回收率的變異系數(shù)在3.34%～10.12%之間。該方法的最低檢出限為0.004～0.02mg/kg、最低定量限為0.01～0.1mg/kg，可滿足農(nóng)藥測定的要求，給相關(guān)部門對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、食品的質(zhì)量監(jiān)控。

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Determination of Plant Hormone Residues in Vegetables and Fruits by High Performance Liquid Chromatography

ZHOU Yan-ming，XIN Xue
(Analysis and Testing Center, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining plant hormone residues in vegetables and fruits was established. Sample preparation was accomplished after extraction with 80% methanol and clean-up on a C18 column prior to analysis using a HPLC system equipped with a UV detector and subsequent quantification by external standard method. The average spike recoveries for 10 species of vegetables or fruits such as tomato, cucumber, capsicum, etc were between 70.23% and 98.10%, with a variation coefficient ranging from 3.34% to 10.12%. The limit of detection of this method was between 0.004 mg/kg and 0.02 mg/kg, and the limit of quantification between 0.01 mg/kg and 0.1 mg/kg. This method meets the national requirements for pesticide determination and is applicable to food quality supervision and control.

high liquid chromatography；fruits and vegetables；plant hormone

TS207.53

A

1002-6630(2010)18-0301-04

2009-11-07

周艷明(1955—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與控制。E-mail：syauzym@163.com