應(yīng)用AFLP技術(shù)鑒別不同地區(qū)的普洱茶曬青毛茶

季鵬章，呂才有，梁名志，張 俊，黃興奇

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 昆明 650203；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650203；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201)

應(yīng)用AFLP技術(shù)鑒別不同地區(qū)的普洱茶曬青毛茶

季鵬章1,2，呂才有3，梁名志1，張 俊1，黃興奇2

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 昆明 650203；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650203；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201)

為鑒別不同地區(qū)的普洱茶曬青毛茶，對(duì)31個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的普洱茶曬青毛茶進(jìn)行AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)分析，一共得到426個(gè)可重復(fù)的位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為94.6%，聚類(lèi)分析主要分為臺(tái)地茶類(lèi)、老樹(shù)茶類(lèi)等兩大類(lèi)。結(jié)果表明，采用以下方法可鑒別不同來(lái)源的普洱茶曬青毛茶：從典型的主要特征峰和染色信號(hào)的最高值和次高值來(lái)區(qū)別；從峰形圖的整個(gè)形狀來(lái)區(qū)分；與對(duì)照的峰形圖比較來(lái)區(qū)分。表明AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)是一種高效的分子標(biāo)記技術(shù)，能成功應(yīng)用于不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的鑒別。

普洱茶；曬青毛茶；AFLP

普洱茶是以云南大葉種茶樹(shù)的鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、日曬等工序制成的曬青毛茶為原料，再經(jīng)發(fā)酵、蒸揉、成型制成各種形狀的成品普洱茶[1]。曬青毛茶是普洱茶特異品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。普洱茶有“青餅”和“熟普”之分，以曬青毛茶為原料，壓制成“青餅”，目前市場(chǎng)流通中交易常稱為“生普”(生茶)，是普洱茶的歷史原形；“熟普”(熟茶)是“生普”在后期經(jīng)渥堆后發(fā)酵所形成的品質(zhì)獨(dú)特的一類(lèi)茶葉[2]。普洱茶因其獨(dú)特品質(zhì)和保健功效，產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分迅速。用著名古茶園所產(chǎn)鮮葉制作的老樹(shù)茶曬青，品質(zhì)優(yōu)于用臺(tái)地茶園所產(chǎn)鮮葉制作的臺(tái)地茶曬青，價(jià)格居高不下；但古茶園曬青產(chǎn)量有限，導(dǎo)致了假冒著名老樹(shù)茶的大量出現(xiàn)。與此同時(shí)，市場(chǎng)上出現(xiàn)了部分用中小葉種、大理茶等非云南大葉種鮮葉制作的假冒“普洱茶”曬青，嚴(yán)重影響了普洱茶的聲譽(yù)。老樹(shù)茶是指由百年以上的古茶園所產(chǎn)鮮葉加工而成的普洱茶，云南省現(xiàn)有古茶園4萬(wàn)hm2；臺(tái)地茶是指采制于新中國(guó)成立后發(fā)展建立的密植條栽茶園，云南省現(xiàn)有該類(lèi)茶園近20萬(wàn)hm2。

曬青毛茶的鑒定目前主要依據(jù)感官審評(píng)、內(nèi)含化學(xué)成分分析等方法，然而，上述方法存在分析費(fèi)用高、標(biāo)準(zhǔn)不一致等問(wèn)題。多種分子標(biāo)記技術(shù)已成功應(yīng)用于茶葉、茶樹(shù)的鑒別，如RAPD[3-4]、RFLP[5]、5S rRNA[6]、AFLP[7]。本實(shí)驗(yàn)在收集云南不同區(qū)域的31份普洱茶曬青毛茶的基礎(chǔ)上，采用AFLP 毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析，旨在區(qū)分不同區(qū)域的老樹(shù)茶、區(qū)分老樹(shù)茶與臺(tái)地茶，為普洱茶原產(chǎn)地保護(hù)提供參考，促進(jìn)普洱茶的持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：共收集曬青毛茶樣本31個(gè)，包括普洱茶的主要原產(chǎn)地——云南省西雙版納州、普洱市、臨滄市等地的曬青毛茶。臨滄二嘎子茶經(jīng)鑒定為大理茶種(Camellia taliensis大理茶)、佛香茶為中小葉種(C. sinensis var. sinensis茶)，其余樣本都是云南大葉種(C. sinensis var. assamica阿薩姆茶)所制曬青毛茶(表1)。

表1 普洱茶曬青毛茶來(lái)源Table 1 Sun-dried tea samples in this study

Taq酶、MgCl2、10×PCR buffer Fermentas MBI公司；EcoRI酶、MseI酶、T4連接酶試劑盒 日本Toyobo公司；瓊脂糖 西班牙Pharmacia公司。

CEQ8000遺傳分析系統(tǒng) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；5415R離心機(jī) 德國(guó) Eppendorf 公司；PTC-200型PCR儀 美國(guó)MJ公司。

1.2 DNA的提取和AFLP-PCR的擴(kuò)增

采用改進(jìn)的CTAB法[8]，用于正式擴(kuò)增的樣品都用RNA酶A進(jìn)行純化。純化后的DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm波長(zhǎng)處的光密度值。用于PCR反應(yīng)的總DNA濃度稀釋到200ng/μL。擴(kuò)增反應(yīng)參照文獻(xiàn)[9]。

1.3 AFLP-毛細(xì)管電泳

整個(gè)流程在遺傳分析系統(tǒng)上完成，采用熒光標(biāo)記技術(shù)和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，電泳結(jié)果通過(guò)軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析并轉(zhuǎn)化為“0、1”矩陣備用，同時(shí)導(dǎo)出電泳分離圖譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

輸入得到的0、1矩陣，用NTSYSpc 2.0[10]對(duì)除M1～M8之外的M9～M19、P1～P5、L1～L7等23個(gè)樣本進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析。同時(shí)分析31個(gè)樣本的電泳分離圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1AFLP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果

兩對(duì)選中的AFLP引物共擴(kuò)增出可重復(fù)的426條帶，檢測(cè)出403個(gè)多態(tài)性(P=94.6%)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的總帶數(shù)為213條，多態(tài)性條帶201.5。引物E-AAC/ M-CTG的P=94.62%，引物E-AAC/M-CTA的P=94.58% (表2)。

表2 所用引物組合及其檢測(cè)效率Table 2 Primers used in AFLP and their screening efficiency

2.2 聚類(lèi)分析

圖1 23個(gè)曬青毛茶的UPGMA 聚類(lèi)圖Fig.1 UPGMA dendrogram based on Jaccard similarities of 23 tea samples

根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)[11]，對(duì)M9～M19、P1～P5、L1～L7等23個(gè)樣品進(jìn)行UPGAM 聚類(lèi)(圖1)，相似性系數(shù)在0.33左右時(shí)，可分為2個(gè)大的類(lèi)群，5個(gè)小類(lèi)群。第一個(gè)大類(lèi)群由勐宋大安(M9)、紫芽(M12)、布朗山(M13)、孟連(P1)、臨滄1(L1)、螞蟻堆(L3)等6個(gè)樣品構(gòu)成；第二個(gè)大類(lèi)群由紫娟(M11)、曼邁(M14)、老茶樹(shù)(M15)、格朗和(M16)、老班章(M17)、巴達(dá)(M18)、勐混(M19)、普洱1(P2)、普洱2(P3)、臨滄2 (L2)、勐庫(kù)(L4)、黑條子茶(L7)等12個(gè)樣品構(gòu)成；5個(gè)小類(lèi)群分別是佛香(M10)、普洱餅(P4)、瀾滄大山(P5)、白鶯山(L5)和二嘎子茶(L6)。

2.3 AFLP-毛細(xì)管電泳圖譜分析

表3 31個(gè)曬青毛茶引物E-AAC/M-CTG的毛細(xì)管電泳圖譜主要峰值Table 3 Main peak values of 31 tea samples in AFLP fingerprint patterns using primer combination E-AAC/M-CTG

表4 31個(gè)曬青毛茶引物E-ACC/M-CTA的毛細(xì)管電泳圖譜主要峰值Table 4 Main peak values of 31 tea samples in AFLP fingerprint patterns using primer combination E-ACC/M-CTA

兩對(duì)31個(gè)AFLP-毛細(xì)管電泳圖譜都有一定的差異，見(jiàn)圖2和表3、4。引物E-AAC/M-CTG 則有明顯的差異，如二嘎子茶96、215特征峰，佛香茶的234特征峰，紫娟的83、198、200特征峰，勐庫(kù)茶的199、511特征峰，瀾滄大山的210特征峰；引物E-AAC/M-CTA的如白鶯山332特征峰等。此外，對(duì)于圖形比較類(lèi)似的樣品，可以依據(jù)染色信號(hào)的最高值和次高值來(lái)進(jìn)行比較，如勐海格朗和、老班章、巴達(dá)，引物E-AAC/MCTA 最高值都是337，但次高值分別為176、132、169。因而可成功地將三者區(qū)分出來(lái)。

3 討 論

3.123 個(gè)曬青毛茶的聚類(lèi)分析

從聚類(lèi)圖可以看出第一個(gè)大類(lèi)群由勐宋、布朗山等6個(gè)樣品構(gòu)成，6個(gè)樣品都為臺(tái)地茶，分析第一大類(lèi)群由臺(tái)地茶構(gòu)成。第二個(gè)大類(lèi)群由老班章、勐混、巴達(dá)、曼邁、格朗和等12個(gè)樣品構(gòu)成。這12個(gè)樣品中老班章、勐混、巴達(dá)、曼邁、格朗和、老茶樹(shù)、勐庫(kù)和黑條子茶等多數(shù)樣本為老樹(shù)茶，分析第二大類(lèi)群主要由老樹(shù)茶構(gòu)成。此外，5個(gè)小類(lèi)群中，佛香茶(C. sinensis var. sinensis)、臨滄二嘎子茶(C. taliensis)與云南大葉種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而臨滄白鶯山則推測(cè)白鶯山是茶樹(shù)種質(zhì)資源庫(kù)，生長(zhǎng)有大理茶等其他茶組植物，白鶯山茶可能混雜有其他茶組植物的基因[12-13]，因而與大葉種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.2 曬青毛茶AFLP-毛細(xì)管電泳鑒別技術(shù)分析

陳亮等[3]應(yīng)用RAPD標(biāo)記對(duì)原產(chǎn)于云南等地的24份野生茶樹(shù)資源進(jìn)行分子鑒定研究。結(jié)果表明，RAPD標(biāo)記在鑒定茶樹(shù)種質(zhì)資源方面非常有效。有3種獨(dú)立的方法可以用于茶樹(shù)種質(zhì)資源的分子鑒定：特殊的標(biāo)記；特異的譜帶類(lèi)型；不同引物提供譜帶類(lèi)型的組合。16個(gè)特異標(biāo)記的存在和3個(gè)特異標(biāo)記的缺失可以鑒定14份資源；Singh等[4]用從市場(chǎng)上購(gòu)來(lái)的10個(gè)不同品牌的紅茶、綠茶，提取DNA，用RAPD鑒別，并認(rèn)為該方法用來(lái)證明某著名品牌的茶葉的來(lái)源，有極大的應(yīng)用性。Matsumoto等[5]用RFLP技術(shù)，以PAL基因?yàn)樘结樿b別日本綠茶的遺傳差異，集合2種限制性內(nèi)切酶，2.3kb的探針能從阿薩姆種茶中鑒別出日本綠茶。Dhiman等[6]報(bào)道從5S rRNA基因片段設(shè)計(jì)了種間的特異PCR探針，并成功地檢測(cè)到在茶葉樣品中摻雜的腰果殼。從上述報(bào)道可看出，分子標(biāo)記在茶樹(shù)種質(zhì)和產(chǎn)品鑒別是可行的。

本研究所用的AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)，一對(duì)引物可擴(kuò)增出200多個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)差異在1bp都能檢測(cè)到，更容易檢測(cè)出材料的細(xì)微差異，同時(shí)采用高效自動(dòng)化技術(shù)，降低了人為操作帶來(lái)的誤差，易于對(duì)擴(kuò)增樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，提高了數(shù)據(jù)的可靠性。通過(guò)對(duì)31個(gè)曬青毛茶的AFLP分析，31個(gè)曬青毛茶的AFLP毛細(xì)管電泳圖譜都有差異，可以通過(guò)以下方法來(lái)區(qū)分不同地區(qū)的曬青毛茶、區(qū)分老樹(shù)茶與臺(tái)地茶：①?gòu)牡湫偷闹饕卣鞣搴腿旧盘?hào)的最高值和次高值來(lái)區(qū)別，如勐庫(kù)茶的199、511特征峰和瀾滄大山的210特征峰；②從峰形圖的整個(gè)形狀來(lái)區(qū)分；③與對(duì)照的峰形圖比較來(lái)區(qū)分。此外，該技術(shù)還可以用于鑒別非云南大葉種加工的曬青毛茶，如本實(shí)驗(yàn)中的佛香茶、二嘎子茶，二者與云南大葉種曬青的AFLP圖譜有明顯的區(qū)別。說(shuō)明AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)可用于普洱茶的真?zhèn)舞b別。

不同區(qū)域曬青毛茶的鑒別技術(shù)是非常復(fù)雜的，梁名志等[14]以云南省的古茶園和臺(tái)地茶園的蒸青茶、曬青茶為樣品，從感官審評(píng)、內(nèi)含品質(zhì)化學(xué)成分和礦物質(zhì)元素檢測(cè)分析得出：老樹(shù)茶與臺(tái)地茶確有差異，但很難用感官審評(píng)、內(nèi)含品質(zhì)化學(xué)成分和礦物質(zhì)元素檢測(cè)等方法來(lái)區(qū)分。云南普洱茶產(chǎn)地廣泛，本次研究用AFLP-毛細(xì)管電泳雖取得一定進(jìn)展，但并沒(méi)有覆蓋所有普洱茶典型產(chǎn)地。今后要對(duì)普洱茶典型產(chǎn)地繼續(xù)開(kāi)展AFLP-毛細(xì)管電泳分析，通過(guò)數(shù)據(jù)、圖譜的積累，形成一整套完整的不同古茶山的AFLP-毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用于不同產(chǎn)地普洱茶曬青毛茶的鑒別。將更能發(fā)揮出AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，為云南普洱茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展服務(wù)。

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AFLP Fingerprinting for Identifying Geographical Origins of 31 Sun-dried Tea (Maocha) Samples

JI Peng-zhang1,2，LCai-you3，LIANG Ming-zhi1，ZHANG Jun1，HUANG Xing-qi2
(1. Institute of Tea Research, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650203, China；2. Institute of Biotechnology and Genetic Germplasm, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650203, China；3. College of Pu , er Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

Amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) markers were employed to identify the geographical origins of 31 sundried tea samples, which was a material for Pu , erh tea processing. A total of 420 polymorphic bands out of 426 reproducible products were amplified. Percentage of polymorphic loci (P) was 94.6%. Dendrogram generated after UPGMA clustering by NTSYS software indicated that 31 samples could be divided into conventional and ancient tea type. There were three methods to identify ancient tea and conventional tea, and to discriminate ancient tea from other geographical origins using AFLP marker: (1) based on the main peak value and the highest and second highest value of dye signal of tea samples. (2) based on the whole AFLP diagram of different samples. (3) cmpare target tea AFLP diagram with control tea group AFLP diagram. The result showed that AFLP marker was an effective tool and a robust method in discrimination of sun-dried tea (Maocha).

Pu , erh tea；sun-dried tea；amplified fragment length polymorphism (AFLP)

TS272.5

A

1002-6630(2010)24-0264-04

2010-08-19

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD58B06)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2006C0012Z)

季鵬章(1975—)，男，副研究員，博士，研究方向?yàn)椴铇?shù)種質(zhì)資源與遺傳改良。E-mail：pengzhji@126.com