黑米花色苷的提取及純化

侯召華，翟虎渠，萬建民，任貴興*

(中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081)

黑米花色苷的提取及純化

侯召華，翟虎渠，萬建民，任貴興*

(中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081)

目的：得到黑米花色苷最佳提取工藝，建立應用大孔吸附樹脂純化花色苷的方法。方法：以矢車菊素-3-葡萄糖苷為跟蹤指標，通過單因素試驗和正交試驗，對影響黑米花色苷提取的各因素進行研究，比較9種大孔吸附樹脂對花色苷的靜態(tài)吸附和解吸性能。結果：黑米花色苷最佳提取條件，提取液乙醇-水-鹽酸體積比為50: 50:0.5，溫度50℃，固液比為1:10(g/mL)，提取時間為1h，提取次數為3次。通過對9種大孔吸附樹脂的比較，確定AB-8為純化黑米的理想吸附樹脂，80%乙醇為洗脫劑，上樣流速為1.0BV/h，解吸流速為2.0BV/h。結論：測定經樹脂純化后提取物中花色苷的含量達到22.59%(粗提物中花色苷含量為3.448%)，樹脂富集倍數為 6.02，此工藝條件純化效果顯著。

黑米；大孔吸附樹脂；花色苷；提取；純化

黑米(Oryza sativa L)作為重要的優(yōu)異稻種資源，因其糙米(穎果)的果皮和種皮內富集有天然花色苷類化合物而得名[1]?；ㄉ帐撬苄渣S酮類色素中最重要的一類，賦予水果、蔬菜、花卉等五彩繽紛的顏色[2]，其保健作用越來越受到人們的重視，近10年來國內外對其生理功能進行了大量的研究，結果表明花色苷可與活性氧反應，減少和消除活性氧對生物體的傷害[3-4]；花色苷具有強抗氧化性[5-6]、抗動脈硬化的作用，可以降低高血脂大鼠的甘油脂水平，改善高甘油脂脂蛋白的分解代謝[7]；抑制膽固醇吸收，降低低密度脂蛋白膽固醇含量；降低血清及肝臟中脂肪含量、抗發(fā)炎性、抗變異、調節(jié)免疫功能、預防心血管疾病等多種功能。

黑米花色苷主要集中在黑米皮中，從黑米中提取花色苷屬于固液浸提過程，由于該過程受到溶劑、溫度、時間、物料比等多種因素的影響，優(yōu)化其最佳的因素與水平是提高黑米花色苷提取率的基礎。目前對花色苷類化合物的提取純化方法主要有大孔樹脂法、CO2超臨界萃取法和高速逆流色譜技術法等[8-9]。其中，大孔樹

脂法是近年來國內外新發(fā)展的處理技術，簡單易行，且具有成本低、效率高、穩(wěn)定性好和容易再生等特點[10]。因此，在分離中，用大孔樹脂作為吸附劑已成為主流，廣泛應用于天然產物的分離純化[11]。

本實驗以矢車菊素-3-葡萄糖苷含量為跟蹤指標，比較9種不同大孔吸附樹脂對花色苷純化效果，旨在優(yōu)化黑米花色苷提取條件，篩選合適的大孔吸附樹脂及其應用條件，獲得純度較高的黑米花色苷提取物，為生產及進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑米品種為新鮮的龍錦1號黑米，市場購得。用粉碎機破碎，過6 0目篩。

矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucopyranoside，AR) 挪威Polyphenols實驗室；乙醇、鹽酸、NaOH等(均為國產分析純)。

大孔吸附樹脂：NKA-9、ADS-5、ADS-17、AB-8、ADS-7、S-8、D4020、ADS-F8、NKA 天津南開大學化工廠。具體型號及物理結構參數見表1。

R210旋轉蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司。

表1 吸附樹脂的型號及物理結構Table 1 Physical properties, appearance and polarity of 9 macroporous resins tested in this study

1.2 方法

1.2.1 浸提條件單因素試驗

表2 黑米花色苷提取單因素試驗設計Table 2 One-factor-at-a-time design for the investigations of 5 main technological parameters

根據預實驗結果可知，影響乙醇提取效果的主要因素有溫度、提取時間、料液比和乙醇體積分數等，實驗分別進行了單因素試驗，提取液中加入0.5%鹽酸，設置了提取液乙醇體積分數；提取溫度、提取時間、料液比、提取次數以確定各因素的影響效果和適宜的參數范圍。

1.2.2 浸提條件正交試驗

以黑米為材料，破碎過60目篩，根據單因素試驗結果。按提取次數(A)、浸提溫度(B)、料液比(C)、浸提時間(D)和乙醇體積分數(E)，五因素四水平的正交試驗，因素水平見表3。

表3 正交試驗水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.3 黑米花色苷含量的測定方法及提取物的制備

采用HPLC方法，以矢車菊素-3-葡萄糖苷為總花色苷的標準物。

10mg矢車菊素-3-葡萄糖苷，加10mL甲醇溶解，過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。色譜條件為：Alltima C18色譜柱 (5μm，4.6mm×250mm)，流動相A為水(含0.1%三氟乙酸)，流動相B為乙腈(CH3CN)；梯度洗脫程序：0～5min(10% B)，5～20min(10% B～15% B)，20～25min(15% B)，25～30min (15% B～18% B)，30～50min (18% B～35% B)，50～55min (35% B～10% B)；檢測波長520nm，樣品進樣量為30μL。

黑米粉提取液經濾紙過濾后，利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，低溫干燥得粗提物。粗提物利用AB-8型大孔樹脂過濾后，濃縮干燥，得純化花色苷提取物。粗提物和純化后花色苷提取物利用甲醇溶解，過0.45μm微孔濾膜，即可進行檢測。

乙醇粗提取物得率的計算：

式中：A為乙醇粗提物得率/%；Ac為粗提物的質量/mg；G為黑米質量/mg。

AB-8純化提取物得率的計算：

式中：B為AB-8純化提取物得率/%；Bc為AB-8

純化提取物質量/mg；G為黑米質量/mg。

花色苷提取率的計算：

式中：M為花色苷提取率/%；X為花色苷提取量/mg；Y為黑米花色苷總質量/mg。

1.2.4 大孔吸附樹脂的選型實驗

大孔吸附樹脂預處理：取一定量樹脂用95%乙醇浸泡24h，用乙醇洗滌，直至洗出液中無白色或褐色渾濁為止，再用去離子水洗至無醇味，濾出樹脂。用相對于大孔吸附樹脂4倍體積 的5%的HCl溶液，以每小時相對于大孔吸附樹脂5倍體積(5BV/h)的流速通過樹脂層，并浸泡3h，用去離子水以5BV/h的流速洗至流出液的pH值為中性；再用4BV的2% NaOH溶液，以5BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡3h，用去離子水以5BV/h的流速洗至流出液的pH值為中性止。

靜態(tài)吸附量及解吸率的測定：準確稱取處理好的濕樹脂(用濾紙吸干表面水)2.0g，裝入100mL具塞錐形瓶中，加入花色苷提取液50mL，室溫振蕩24h，使樹脂充分吸附后，測定剩余溶液的濃度，按下式計算各樹脂室溫下對花色苷的吸附量Q。

式中：Q為吸附量/(mg/g)；Co為起始質量濃度/ (mg/mL)；Ce為平衡質量濃度/(mg/mL)；V為吸附液體積/mL；m為樹脂質量/g。

吸附飽和的樹脂，利用80%乙醇進行解析，充分解析后，測濾液中花色苷的含量。按下列公式計算解吸率D。

式中：D為解吸率/%；Cd為解吸液質量濃度/(mg/mL)，Vd為解吸液體積/mL。

1.2.5 大孔吸附樹脂對黑米花色苷的靜態(tài)吸附實驗

準確稱取篩選出來的大孔吸附樹脂2.0g(使用前用濾紙吸干樹脂表面的水分)，置于三角瓶中，加入一定濃度的花色苷溶液50mL，封口置于搖床中，室溫條件下振蕩24h。分別在吸附時間為20、40、60、80、100、120、140、160min時測定溶液中花色苷的濃度，計算大孔吸附樹脂對花色苷隨著時間變化的吸附量，做出大孔樹脂的靜態(tài)吸附曲線，確定大孔樹脂最佳靜態(tài)吸附時間。

1.2.6 不同乙醇體積分數對大孔吸附樹脂解吸特性的影響

吸附飽和的AB-8樹脂5份，分別用20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液進行解吸，計算不同體積分數度乙醇溶液對黑米花色苷的解吸率。

1.2.7 上樣流速對AB-8型大孔吸附樹脂的吸附率的影響

黑米花色苷粗提液，分別采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0BV/h的流速，分析不同流速下的AB-8型大孔吸附樹脂對黑米花色苷吸附率的影響。

1.2.8 解吸流速對AB-8型大孔吸附樹脂的解吸率的影響

用80%乙醇溶液洗脫，分別采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0BV/h的流速，把黑米花色苷洗脫出來。分析流速對花色苷解吸率的影響。

1.2.9 大孔吸附樹脂對花色苷提取的純化效果

經過單因素試驗、正交試驗確定了黑米花色苷的最佳提取工藝。篩選出最佳大孔吸附樹脂，利用其進行花色苷純化富集，將黑米花色苷提取液在大孔樹脂上進行富集，以得到純度較高的花色苷提取物。

2 結果與分析

2.1 黑米花色苷浸提條件

2.1.1 單因素試驗結果

2.1.1.1 提取次數的影響

圖1 提取次數對花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of extraction times on anthocyanins yield

在提取溫度為30℃、固液比為1:10、乙醇體積分數為85%、提取時間為2h的條件下，分析提取次數對提取黑米花色苷的影響。由圖1可知，隨提取次數增加，花色苷的提取量逐步增加，尤其兩次提取比一次提取有顯著增加。

2.1.1.2 提取溫度的影響

在乙醇體積分數為85%、提取時間為2h、固液比為1:10、提取次數為2次的條件下，分析提取溫度對提

取黑米花色苷的影響。從圖2可以看出，隨提取溫度的升高，花色苷提取量相應增加，當溫度達到60℃時，提取量達最高值，此后，隨溫度繼續(xù)升高，花色苷含量開始降低。因此，選擇提取溫度為6 0℃。

圖2 提取溫度對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on anthocyanins yield

2.1.1.3 固液比的影響

圖3 固液比對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on anthocyanins yield

在提取溫度為30℃、提取時間為2h、乙醇體積分數為85%、提取次數為2次的條件下，分析固液比對提取黑米花色苷的影響。由圖3顯示，當固液比為1:8和1:10時，花色苷提取量較高。當繼續(xù)降低固液比時，提取量反而下降，分析原因可能是，當固液比降低到一定程度時，原料內部與溶劑之間溶質已經達到平衡，反而使雜質溶解增加，相應減少花色苷的提取量。

2.1.1.4 提取時間的影響

圖4 提取時間對花色苷提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanins yield

在提取溫度為30℃、固液比為1:10、乙醇體積分數為85%、提取次數為2 次的條件下，分析提取時間對提取黑米花色苷的影響。結果如圖4所示，隨提取時間的延長，花色苷提取量迅速增加，但1.5h以后增加量不顯著。當提取時間為2h時，花色苷的提取量基本持平，從節(jié)約時間和能耗角度分析，選擇提取時間1.5h為宜。

2.1.1.5 乙醇體積分數的影響

圖5 乙醇體積分數對花色苷提取量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on anthocyanins yield

在提取溫度為30℃、提取時間為2h、固液比為1:10、提取次數為2次的條件下，分析乙醇體積分數對提取黑米花色苷的影響。從圖5可以看出，在乙醇體積分數為55%時，花色苷提取量顯著增加，隨后增加乙醇體積分數，提取量增加不顯著。表明55%的乙醇體積分數為宜。

2.1.2 正交試驗結果

表4 正交試驗方案及其結果Table 4 Orthogonal array design matrix and experimental values of anthocyanins yield

單因素試驗表明，利用溶液進行花色苷提取時，提取時間、提取溫度、固液比、乙醇體積分數和提取次數對提取率均有不同程度的影響。因此在單因素試驗的基礎上，通過L16(45)五因素四水平正交試驗來進一步優(yōu)化花色苷的提取工藝參數，每組正交試驗重復處理3次。應用SAS6.0統計分析軟件進行數據處理，正交試驗結果見表4。

從表4可以看出，每個因素對花色苷的提取效果的影響不同。由極差分析可知，對花色苷提取效果影響的主次順序為：提取次數＞固液比＞提取溫度＞ 提取時間＞ 乙醇體積分數。經表5方差分析表明，提取次數對黑米花色苷的提取效果有顯著影響，其他因素水平的改變對提取率影響不顯著。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance for anthocyanins yield with various extraction conditions

最佳優(yōu)化組合為A4B1C4D2E1，即溶劑乙醇-水-鹽酸體積比為50:50:0.5、溫度50℃、固液比為1:10、每次提取時間為1h。

2.1.3 黑米花色苷的提取率

取新鮮黑米100g(總花色苷含量為787.67mg/100g，此為在上述最佳條件下提取5次所得花色苷總和)，對其進行提取，分取3次提取液，檢測提取液中花色苷的提取率。

表6 黑米花色苷提取率Table 6 Anthocyanins yields from black rice extracted under optimized conditions for the first, second and third time

由表6可知，以提取率為指標，3次合計提取率達84.72%，表明最佳浸提條件效果是較理想, 最終確定提取次數為3次。

2.2 大孔吸附樹脂柱層析對黑米花色苷的純化

2.2.1 大孔吸附樹脂的選型

9種不同型號的大孔吸附樹脂對花色苷的靜態(tài)吸附及解吸實驗結果表明，不同型號的大孔樹脂對黑米花色苷的吸附效果明顯不同，在所選擇的9種樹脂中，D4020、ADS-5、AB-8、NKA型大孔吸附樹脂對花色苷都有較高的吸附性能。

表7 不同大孔樹脂對花色苷的吸附率及解吸率Table 7 Adsorption and desorption rates of different macroporous resins towards black rice anthocyanins

大孔吸附樹脂在分離有效成分方面是利用其吸附的可逆性(即解吸性)。由于樹脂極性不同，吸附作用力的強弱也有差別，因而解吸難易也不同，所以較高解吸率也是樹脂篩選的重要環(huán)節(jié)。利用8 0%乙醇進行解析，NKA-9，ADS-7都具有較高的解吸率，但其吸附率較低。

綜上分析各因素，確定AB-8型大孔吸附樹脂用于黑米花色苷的純化。

2.2.2 AB-8型大孔吸附樹脂對黑米花色苷的靜態(tài)吸附分析

圖6 AB-8型大孔樹脂對黑米花色苷的靜態(tài)吸附曲線Fig.6 Static adsorption curve of black rice anthocyanins onto AB-8

由圖6可知，在靜態(tài)吸附過程的前2h內，AB-8大孔吸附樹脂對黑米花色苷吸附量迅速增加。在吸附時間達到2h后，AB-8型大孔吸附樹脂對黑米花色苷的靜態(tài)吸附基本達到飽和。在2h之后隨著吸附時間的增加，吸附量增加基本不變。

2.2.3 乙醇體積分數對大孔樹脂的解吸率的影響

圖7 乙醇體積分數對花色苷解吸率的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on desorption rate of black rice anthocyanins

把已經吸附好的樹脂先用6BV的蒸餾水以2BV/h的流速洗脫，再用6BV的20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脫，收集洗脫液，計算解吸率。

由圖7可知，20%和40%的乙醇解吸率低，隨著乙醇體積分數的增加，解吸率逐漸上升。 80%乙醇可把大孔樹脂上約80%的花色苷解吸下來，從經濟角度考慮，沒有必要使用更高體積分數的乙醇。

2.2.4 上樣流速對黑米花色苷吸附率的影響

圖8 上樣流速對吸附率的影響Fig.8 Effect of flow rate for sample loading onto AB-8 on adsorption rate of black rice anthocyanins

由圖8可知，隨著上樣流速的增加，大孔樹脂對黑米花色苷的吸附性能下降，流速不同，花色苷與樹脂的接觸時間不同，吸附率也會發(fā)生變化。當流速達到1BV/h后，樹脂的吸附率明顯下降，流速降低，樹脂的吸附率也較高，但導致實驗的周期延長，所以把吸附流速控制為1BV/h。

2.2.5 解吸流速對解吸率的影響

圖9 洗脫劑流速對解析率的影響Fig.9 Effect of elution solvent flow rate on desorption rate of black rice anthocyanins

由圖9可知，隨著洗脫液流速的增加，大孔樹脂對黑米花色苷的解吸性能呈下降趨勢，說明流速增加不利于樹脂對花色苷的解吸，可能是若流速過快，洗脫劑不能與被吸附的花色苷充分作用而將其從樹脂上洗脫出來。但流速過低，導致實驗的周期延長，所以把解吸流速控制為2BV/h。

2.2.6 大孔吸附樹脂對花色苷提取純化效果

根據大孔吸附樹脂的選型結果，用AB-8作為分離純化花色苷的吸附劑，上層析柱，用80%乙醇溶液進行洗脫。收集洗脫液后，減壓濃縮后，干燥，分析其花色苷含量。

表8 AB-8對花色苷提取的效果Table 8 Anthocyanins contents in crude and purified extracts from black rice and corresponding yields

由圖8可知，黑米花色苷提取物經過大孔吸附樹脂處理后，其純度大大提高，花色苷純度提高了6.02倍，表明用大孔吸附樹脂對黑米花色苷提取純化效果是較理想的。

3 討 論

酸性乙醇溶液法是提取色素最常用的一種方法，其方便、快捷、簡單。文獻報道，酸化水溶液對黑米中的花色苷類物質也具有相當好的萃取能力，可以提高色素的純度[12]。為得到黑米色素提取的最佳工藝條件，不少學者對其做了大量的研究。

張福娣等[13]對浸提時間、浸提溫度、料液比、浸提劑的體積分數4個因素進行正交試驗，表明浸提劑(乙醇)和浸提溫度對色素的浸提率有顯著的影響，料液比和浸提時間對浸提率影響不顯著，最佳的浸提工藝條件為浸提溫度80℃、浸提時間30min、料液比1:10，浸提劑體積分數為50%的乙醇溶液。張名位[14]通過正交試驗優(yōu)化出黑米色素的最佳浸提條件為：以60%乙醇為溶劑，黑米皮料液比為1:4，60℃，浸提4h。 本研究確定了50%乙醇溶液 (含有0.5% HCl)作為浸提劑，料液比為1:10，浸提溫度50℃，浸提時間1h，3次提取，浸提率達到了84.72%。Cacace等[15]認為，提高浸提溫度會導致黑醋栗花色苷降解增加，從而降低提取物中花色苷的含量，所以本實驗采用了較低的浸提溫度，每次提取時間為1h，這樣可以縮短花色苷的受熱時間。

大孔吸附樹脂是一類非離子型高分子吸附劑，能夠借助范德華力和氫鍵從溶液中吸附各種有機物[16]，具有簡單易行、成本低、效率高、穩(wěn)定性好和容易再生等優(yōu)點，因此，大孔樹脂廣泛應用于天然產物的分離制備。侯方麗等[17]對分離黑米皮的大孔吸附樹脂進行了篩選，確定AB-8為最佳樹脂，黑米皮經AB-8大孔樹脂純化后，其總花色苷含量較純化前的提高2.38倍。本實驗結果顯示，AB-8大孔樹脂對黑米皮花色苷具有較好的吸附和解吸能力，上樣流速1BV/h，以體積分數為80%乙醇為解吸劑，洗脫速度為2BV/h，經AB-8大孔

樹脂純化后，其總花色苷含量較純化前的提高6.02倍，得含22.59%花色苷的提取物。說明該方法具有收率高、成本低、操作簡單等特點，易于實現黑米的工業(yè)化生產，推動功能性黑米食品的發(fā)展。

4 結 論

通過正交試驗優(yōu)化出最佳提取工藝為乙醇-水-鹽酸比例50:50:0.5、溫度50℃、固液比1:10、提取時間為每次1 h、提取次數3次。

通過大孔吸附樹脂吸附及解吸能力比較，篩選出AB-8為最佳樹脂，洗脫劑為80%乙醇溶液，上樣流速為1BV/h，解吸流速為2BV/h。

測定經(AB-8)樹脂純化后提取物中花色苷的含量達到22.59% (粗提物中花色苷含量為3.448%)。實驗表明，經過大孔樹脂純化，可去除了大量雜質，提高黑米花色苷的含量。

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Extraction and Purification of Anthocyanins from Black Rice

HOU Zhao-hua，ZHAI Hu-qu，WAN Jian-min，REN Gui-xing*
(Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

To maximize anthocyanins yield from black rice extracted with ethanol solution, one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to examine the optimal values of 5 main technological parameters. Cyanidin-3-glucoside was served as the

ubstance for the quantification of anthocyanins. Subsequently, the crude anthocyanin extract obtained was purified by macroporous resin absorption. Results showed that an optimal anthocyanins yield was achieved through extracting the material with a 10-fold (mL/g) volume of a mixture composed of absolute ethanol, water and hydrochloric acid (50: 50:0.5, V/V) for 1 h 3 times each time at 50 ℃. Among 9 macroporous resins tested, AB-8 exhibited the best compromise between high adsorption and high desorption rates so as to be used to purify the crude anthocyanin extract from black rice. In the purification, the optimal elution solvent was 80% aqueous ethanol and the optimal values of flow rate for sample loading onto AB-8 and elution solvent flow rate were 1.0 and 2.0 BV/h, respectively. The purified anthocyanin extract was determined to have 22.59% anthocyanins content (the value in the crude anthocyanin extract 3.448%) with a 6.02-fold enrichment, which demonstrated an effective purification.

black rice；macroporous resins；anthocyanins；extraction；purification

TS218

A

1002-6630(2010)10-0053-07

2009-08-03

農業(yè)部公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項經費項目(200803056)

侯召華(1982—)，男，博士研究生，研究方向為糧食功能成分。 E-mail：kevin19820427@163.com

* 通信作者： 任貴興(1963—)，男，研究員，博士，研究方向為糧食作物功能成分的開發(fā)利用。E-mail：renguixing@caas.net.cn