高效液相色譜法測(cè)定南瓜果肉中胡蘆巴堿含量

徐雅琴，王 翀，崔崇士

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

高效液相色譜法測(cè)定南瓜果肉中胡蘆巴堿含量

徐雅琴1，王 翀1，崔崇士2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

以脫脂南瓜粉為原料，70%乙醇溶液為溶劑，微波輔助萃取樣品中的胡蘆巴堿，建立南瓜果肉中胡蘆巴堿含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)過程中，采用的色譜柱為Agilent-ZORBX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)柱，流動(dòng)相為0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)，流速為0.6mL/min，進(jìn)樣量為10μL，檢測(cè)波長265nm，柱溫為室溫。研究結(jié)果表明，胡蘆巴堿在5.6～134.4μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9999(n=5)；平均回收率為97.09%，RSD為1.02%(n=5)。本法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于南瓜果肉中胡蘆巴堿的含量測(cè)定。此外，采用此方法測(cè)定了13個(gè)品種南瓜果肉中胡蘆巴堿的含量，結(jié)果表明胡蘆巴堿含量為172.5～475.5μg/g。

南瓜；胡蘆巴堿；高效液相色譜法(HPLC)

南瓜，又名倭瓜、番瓜、飯瓜、窩瓜等，胡蘆科南瓜屬的一年生蔓性草本植物，以其營養(yǎng)價(jià)值極高被世界營養(yǎng)學(xué)家公認(rèn)為是21世紀(jì)的保健食品[1]。南瓜的果實(shí)、莖、葉、花朵和種子中含有豐富的類胡蘿卜素、南瓜多糖、抗菌活性蛋白、降血糖多肽物質(zhì)等[2-4]。除此之外南瓜果肉含有生物堿——胡蘆巴堿。胡蘆巴堿是一種植物激素類活性成分，具有抗腫瘤作用及降血糖活性，還可有效治療一些皮膚疾病，例如牛皮癬[5-9]等。

目前有關(guān)胡蘆巴堿的定量方法文獻(xiàn)上報(bào)道主要采用高效液相色譜法(HPLC)[10-15]，南瓜中胡蘆巴堿含量的測(cè)定國內(nèi)僅見張春英等[11]報(bào)道采用正相氨基鍵合相色譜柱，以乙腈-水(80:20)為流動(dòng)相，得到了較好的分離效果。本實(shí)驗(yàn)以南瓜果肉為試材，采用反向C18色譜柱，確定HPLC的測(cè)定條件，拓展南瓜果肉中胡蘆巴堿含量測(cè)定的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

方法探討實(shí)驗(yàn)用市售南瓜，方法應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)瞎嫌蓶|北農(nóng)業(yè)大學(xué)南瓜研究所提供。

甲醇(色譜純)；磷酸(色譜純)；胡蘆巴堿對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所，其他試劑均為分析純。

H P 1 1 0 0型高效液相色譜儀[配置四元梯度泵(G 1 3 1 4 A)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G 1 3 1 3 A)、紫外檢測(cè)器(G1314A)、ZORBX SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)]美國Agilent公司；XH-100A微波催化合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生生物技術(shù)有限公司。

1.2 原料預(yù)處理

將南瓜洗凈后，去皮、去瓤、切片、烘干、粉碎成粉后備用。

1.3 色譜條件的選擇

采用Agilent-ZORBX SB-C18色譜柱(4.6mm× 150mm，5μm)，檢測(cè)波長為265nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣體積10μL，流速為0.6mL/min分別考察不同比例的甲醇-水、乙腈-水及磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)分離效果的影響。

1.4 樣品處理

將南瓜粉過40目篩后，置索氏提取器中，加無水乙醚連續(xù)回流12h脫脂，得脫脂南瓜粉。揮盡乙醚后精密稱取約5g的脫脂南瓜粉，加70%乙醇溶液100mL，微波萃取7min，過濾，乙醇沉后再次過濾，回收乙醇[16]。提取物用甲醇溶解，定容于25mL容量瓶中。0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

胡蘆巴堿對(duì)照品約10mg，精密稱取，置于10mL容量瓶中，甲醇定容，最后得到質(zhì)量濃度為1.12mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃冰箱存放。分別精密吸取儲(chǔ)備液0.05、0.2、0.4、0.8、1.2mL于10mL容量瓶中，甲醇稀釋并定容，搖勻配制成質(zhì)量濃度分別為5.6、22.4、44.8、89.6、134.4μg/mL系列對(duì)照品溶液，進(jìn)行液相色譜分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 方法學(xué)考察

對(duì)所建立測(cè)定方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度、回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.7 樣品測(cè)定

按1.4節(jié)樣品處理方法對(duì)13個(gè)品種的南瓜進(jìn)行處理，進(jìn)行液相色譜分析，進(jìn)樣量10μL，采用外標(biāo)法定量，測(cè)定胡蘆巴堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)流動(dòng)相選擇不同比例的甲醇-水、乙腈-水溶液作為流動(dòng)相都不能將樣品中的胡蘆巴堿與其他物質(zhì)進(jìn)行分離。當(dāng)流動(dòng)相采用0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)溶液時(shí)，分離效果較好，其對(duì)照品和樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1 對(duì)照品(A)及樣品(B)的HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of trigonelline standard and a pumpkin pulp sample

由圖1可看出，對(duì)照品和樣品的出峰時(shí)間分別在3.165nm和3.167nm，基本一致，而且樣品中胡蘆巴堿與相鄰物質(zhì)的分離效果較好。因此確定流動(dòng)相為0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)。

2.2 線性范圍的考察

分別取胡蘆巴堿含量為5.6、22.4、44.8、89.6、134.4μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按色譜條件1.3節(jié)進(jìn)行分析，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)、對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制工作曲線。結(jié)果得到回歸方程：Y=22.381X +59.627，相關(guān)系數(shù)r=0.9999(n=5)。表明對(duì)照品溶液在5.6～134.4μg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，按所建立的方法進(jìn)樣分析，分別在0、2、4、8、1 2、2 4、4 8、9 6 h測(cè)定峰面積，平均值為881.9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.27% (n=5)。表明供試品溶液在96h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取5份脫脂南瓜粉樣品，質(zhì)量分別為5.0132、5.0096、4.9982、5.0201、5.0105g，樣品按1.4節(jié)方法

處理，進(jìn)樣分析，測(cè)定胡蘆巴堿含量分別為186.1、182.4、178.9、189.6、181.7μg/g，平均含量為183.7μg/g，RSD為2.27%(n=5)。該結(jié)果表明方法重現(xiàn)性好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，按1.3節(jié)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果分別為876.4、872.9、875.8、874.1、869.7，平均值為873.8，RSD為0.31%(n=5)。表明該方法精密度很高。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取6份已知含量的脫脂南瓜粉樣品約2.5g，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.2、0.4、0.4、0.6、0.6mL，揮盡甲醇，按1.4節(jié)樣品處理方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 1 Average recovery for trigonelline in a total of 6 real samples spiked at 3 levels repeated twice each in 5 replicates

表1測(cè)量結(jié)果表明，加樣回收實(shí)驗(yàn)中在胡蘆巴堿出峰時(shí)間處沒有意外峰出現(xiàn)，說明供試品種含有與對(duì)照品出峰時(shí)間相同的物質(zhì)。平均回收率為97.09%，RSD為1.02%，滿足測(cè)定要求。

2.7 不同南瓜品種胡蘆巴堿含量的測(cè)定

表2 不同南瓜品種中胡蘆巴堿的含量Table 2 Results of determination of trigonelline in different cultivars of pumpkin powder by the method

不同品種南瓜果肉中胡蘆巴堿的含量測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，所測(cè)脫脂南瓜粉中胡蘆巴堿的含量為172.5～475.5μg/g。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)首次采用反相C18色譜柱，建立南瓜果肉中胡蘆巴堿含量的測(cè)定方法。本測(cè)定方法操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于對(duì)南瓜果肉中胡蘆巴堿成分的定性與定量的分析。

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HPLC Determination of Trigonelline in Pumpkin Pulp

XU Ya-qin1，WANG Chong1，CUI Chong-shi2
(1. College of Science, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China；2. College of Horticulture, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China)

A method for the determination of trigonelline in pumpkin flesh was established using high performance liquid chromatography (HPLC). Samples were defatted in a Soxhlet extractor with absolute ethyl ether as solvent and extracted with 70% aqueous ethanol with microwave assistance. An Agilent Zorbax SB-C18 column kept at ambient temperature was used for the chromatographic separation with 0.40 mmol/L aqueous solution of phosphoric acid (pH 3.2) as a mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min. The injection volume was 10 μ L. The detection wavelength was set at 265 nm. Results showed that the developed standard curve of trigonelline exhibited good linearity over the concentration of 5.6 to 134.4 μ g/mL, with a correlation coefficient of 0.9999 (n = 5). The average recovery for trigonelline in a total of 6 real samples spiked at 3 levels repeated twice each in 5 replicates was 97.09%, with a relative standard deviation of 1.02%. This method proved to be simple, accurate and of good repeatability so as to be most suitable for the determination of trigonelline in pumpkin pulp. Thirteen cultivars of pumpkin pulp were determined by the method to have very different trigonelline contents ranging between 172.5μ g/g and 475.5 μ g/g.

pumpkin；trigonelline；high performance liquid chromatography

TS218.1

A

1002-6630(2010)10-0209-03

2009-08-30

黑龍江省自然科學(xué)基金資助重點(diǎn)項(xiàng)目(ZJN0606-01)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11521028)

徐雅琴(1964—)，女，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物及其開發(fā)研究。E-mail：xu-yaqin@163.com