黃紅亮,邵定勇,羅滿林,陳瑞愛

(廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興 527400)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaningmultisystem icwasting syndrome,PMWS)的原發(fā)病原,后來發(fā)現(xiàn)PCV-2還與豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrom e,PDNS)、先天性震顫(Congenital termors,CT)、后期流產(chǎn)(Late-term abortions)和滲出性皮炎(Exudative epidermitis)等疾病密切相關(guān),統(tǒng)稱為PCV-2相關(guān)疾病。臨床主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、進(jìn)行性消瘦、呼吸困難、黃疸、腹瀉、皮炎、繁殖障礙、震顫等[1]。淋巴系統(tǒng)衰竭是PCV-2感染的特征性病變,導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制,易于誘發(fā)多種病毒及細(xì)菌的混合感染與繼發(fā)感染。自1991年加拿大首次發(fā)生PMWS以來,PCV-2感染迅速在北美洲、南美洲、歐洲、亞洲、大洋洲和非洲的各個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家蔓延。我國(guó)為養(yǎng)豬大國(guó),PCV-2感染也相當(dāng)嚴(yán)重,全國(guó)各大小豬場(chǎng)均存在PCV-2感染的報(bào)道[2]?？梢?PCV-2已經(jīng)成為阻礙當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一。疫苗免疫作為防控PCV-2的主要手段,國(guó)內(nèi)外研究者正在著力研究與開發(fā)各種PCV-2疫苗。滅活疫苗與亞單位疫苗是早期研究的疫苗,已有2個(gè)滅活疫苗與2個(gè)亞單位疫苗在美國(guó)及歐洲注冊(cè)上市,這些疫苗為當(dāng)?shù)豍CV-2感染的控制發(fā)揮了重要作用,但免疫效果仍然有待進(jìn)一步提高,我國(guó)目前沒有任何相關(guān)疫苗注冊(cè)上市。弱毒疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn),但病毒增殖能力、毒力返強(qiáng)等問題仍需要解決。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,活載體疫苗、核酸疫苗等新型疫苗正在積極研究中,成為目前的主要研究熱點(diǎn)。

1 PCV-2的基因結(jié)構(gòu)

豬圓環(huán)病毒(PCV)是圓環(huán)病毒屬的代表種,直徑平均為17 nm,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒。根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差異,PCV被劃分為無致病性PCV-1和致病性PCV-2兩個(gè)基因型。PCV基因組為單股環(huán)狀DNA,PCV-1基因組全長(zhǎng)為1 759 bp,PCV-2基因組全長(zhǎng)為1 767 bp或1 768 bp,兩者的同源性為68%～76%。PCV-2基因組共編碼11個(gè)開放閱讀框(open reading frames,ORFs),ORF1-ORF11,ORF1、ORF5、ORF7、ORF10位于病毒 DNA 鏈上,ORF2 、ORF3 、ORF4 、ORF6 、ORF8 、ORF9 、ORF11則由互補(bǔ)鏈編碼,其中ORF1、ORF2是兩個(gè)最大的閱讀框,目前僅發(fā)現(xiàn) ORF1、ORF2、ORF3編碼蛋白,還未見有其他蛋白研究[1]。有研究表明ORF6/7/8可能與病毒復(fù)制有關(guān),ORF3/4/5可能與病毒毒力相關(guān),ORF11可能與病毒潛伏期有關(guān),而ORF9/10則可能不存在或與病毒復(fù)制及毒力無關(guān)[3]。2個(gè)主要編碼蛋白分別為由ORF1編碼的與復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白和由ORF2編碼的衣殼蛋白Cap蛋白。2個(gè)基因型之間ORF1比較保守,同源性為83%,ORF2的同源性為 67%～70%。PCV DNA以滾環(huán)方式復(fù)制,ORF1與ORF2間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)TAGTATTAC(PCV-1)或 AAGTATTAC(PCV-2)為復(fù)制起點(diǎn)[4]。

2 PCV-2的主要蛋白

2.1 Rep蛋白

ORF1基因產(chǎn)生2個(gè)大小不同的共線性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,分別編碼 Rep蛋白與 Rep＇蛋白,Rep蛋白由312 aa組成,分子質(zhì)量約為35 ku,Rep＇蛋白由168 aa組成,分子質(zhì)量約為19 ku,兩者都是病毒基因組復(fù)制必需的蛋白,且兩者必須共同作用才能啟動(dòng)病毒的復(fù)制。ORF1基因在所有圓環(huán)病毒中高度保守,且功能上可以互相替代。在Rep蛋白中存在3個(gè)典型的滾環(huán)復(fù)制結(jié)構(gòu)域酶起始復(fù)制基序:motifⅠ(FTLNN)、m otifⅡ(HLQG)和 motifⅢ(YCSK),位于解旋酶結(jié)構(gòu)域的dNTPs結(jié)合基序(p環(huán))或稱為Walker A和Walker B,這些結(jié)構(gòu)對(duì)于Rep蛋白與非編碼區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合和維持Rep蛋白的結(jié)構(gòu)與功能都至關(guān)重要[3,5]。Rep蛋白存在有兩個(gè)T淋巴細(xì)胞表位,分別位于第81位～100位和第201位～220位氨基酸[6],由于細(xì)胞免疫在PCV-2免疫保護(hù)具有一定的作用,Rep蛋白也具有免疫保護(hù)能力。

2.2 Cap蛋白

ORF2基因編碼病毒的Cap蛋白,由基因組的互補(bǔ)鏈合成。Cap蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,由234 aa組成,分子質(zhì)量約為28 ku。PCV-2與PCV-1 Cap蛋白之間雖然具有共同的抗原表位,但不存在交叉反應(yīng)。經(jīng)多肽掃描分析,Cap蛋白的第65 aa～87 aa,113 aa～139 aa和193 aa～207 aa為PCV-2型特異性的抗原位點(diǎn),第169 aa～183 aa為PCV-1和PCV-2共有的抗原表位。Shang S B等利用Cap蛋白單克隆抗體鑒定了5個(gè)線性B細(xì)胞表位,231 aa～233 aa與 195 aa～202 aa為 PCV-2特異性,92 aa～103 aa為PCV-1特異性,156 aa～162 aa和179 aa～192 aa為兩者共有,且利用中和抗體將PCV-2分為 3種抗原表型,即1766PCV-2、1767PCV-2與1768PCV-2[7]。另外,PCV-2 Cap蛋白的 47 aa～63 aa、165 aa～ 200 aa和230 aa～ 233 aa區(qū)域內(nèi) ,至少存在5個(gè)不同但彼此重疊的構(gòu)象型抗原表位。目前發(fā)現(xiàn)的這些抗原表位主要為B細(xì)胞表位。研究證明,Cap蛋白為PCV的主要保護(hù)性免疫蛋白。

2.3 ORF3編碼蛋白

盡管人們很早便知道ORF3基因的存在,但最近幾年才對(duì)其功能有所研究。PCV-1和 PCV-2的ORF3分別編碼由206個(gè)氨基酸和104個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),分子質(zhì)量分別為23.2 ku和11.9 ku。ORF3為病毒復(fù)制非必需基因,經(jīng)典途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,野生型 PCV-2較缺失ORF3的重組PCV-2導(dǎo)致更嚴(yán)重的病毒血癥、淋巴結(jié)病理變化,T淋巴細(xì)胞明顯減少,且病毒載量大,說明ORF3可能為PCV-2的另一個(gè)毒力因素[8-9]。但是,ORF3編碼蛋白第31 aa～50 aa含有一個(gè)T淋巴細(xì)胞表位[6],說明其在免疫保護(hù)方面具有一定的作用。

3 PCV-2疫苗研究

3.1 滅活疫苗

PCV-2滅活疫苗無毒,安全,性能穩(wěn)定。在國(guó)外有Merial公司研制的全病毒滅活疫苗Circovac,及Fort Dodge公司研制的PCV-1與PCV-2嵌合全病毒滅活疫苗Suvaxyn PCV-2 one dose。Circovac主要用于母豬免疫接種,其所產(chǎn)小豬母源抗體可在5周內(nèi)抵抗PCV-2感染,也可用于保育豬、育肥豬的免疫接種,免疫后可以減輕病理組織損傷,降低死亡率。目前Circovac在歐洲許多國(guó)家均獲得上市許可。Suvaxyn PCV-2 one dose在美國(guó)已獲得完全許可,在加拿大已申請(qǐng)注冊(cè),主要用于仔豬免疫接種,激發(fā)的免疫反應(yīng)不受母源抗體影響,可有效預(yù)防PCV-2病毒血癥,減少淋巴組織損傷,降低仔豬死亡率[10]。在國(guó)內(nèi)目前沒有注冊(cè)的PCV-2疫苗,但一些科研單位有PCV-2滅活疫苗研制。總體而言,滅活疫苗對(duì)機(jī)體刺激時(shí)間比較短,需多次接種,且效果不太理想;而且PCV-2在細(xì)胞上增殖滴度低,其制備費(fèi)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他疫病的滅活疫苗。因此,新型PCV-2疫苗研究成為趨勢(shì),包括基因工程疫苗和核酸疫苗等,以期降低疫苗成本,提高免疫效力。

3.2 亞單位疫苗

PCV-2 Cap蛋白被認(rèn)為是主要免疫原性蛋白,且與PCV-1 Cap蛋白無交叉保護(hù)性,因此,國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者均將PCV-2 Cap蛋白單獨(dú)表達(dá)以研制能有效防治PCV-2感染的亞單位疫苗。常用的表達(dá)系統(tǒng)為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),利用桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的Cap蛋白能自我組裝成類病毒粒子,免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)高水平的ELISA抗體及PCV-2特異性的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。國(guó)外已注冊(cè)的疫苗中兩種亞單位疫苗為Intervet研制的 Porcilis PCV和Boehringer-Ingelhein研制的CircoFLEX。兩者均為桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白亞單位疫苗,兩劑量的Porcilis PCV及單劑量的CircoFLEX免疫接種3周齡及以上商品豬,均能產(chǎn)生伴有中和抗體的體液免疫反應(yīng),能減輕病毒血癥,減少淋巴結(jié)組織損傷及PCV-2病毒載量[10],對(duì)歐洲及北美的PCV-2的控制發(fā)揮了巨大作用。單劑量的Porcilis PCV同樣能部分地抵抗PCV-2感染[11]。

3.3 減毒活疫苗

制備減毒活疫苗包括兩種方法,一種為傳統(tǒng)方法,即將病原體在非易感動(dòng)物或細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代,導(dǎo)致病原體毒力降低;另一種為通過基因工程方法使毒力基因缺失或重組,獲得減毒病原體。Fenaux M等[12]將 PCV-2分離株在 PK-15細(xì)胞中連續(xù)傳至120代,發(fā)現(xiàn)第120代病毒(PCV-2 VP120)基因組中Cap基因發(fā)生了2個(gè)堿基突變,第110位的脯氨酸變?yōu)楸彼?及第191位的精氨酸變?yōu)榻z氨酸。用PCV-2 VP120和PCV-2 VP1感染SPF豬,PCV-2 VP120感染后的病毒血癥發(fā)生率低于PCV-2 VP1,且持續(xù)時(shí)間短,血清中 PCV-2基因組拷貝量、眼觀病變及組織學(xué)病變也較 PCV-2 VP1感染豬輕,表明體外傳代可增強(qiáng)PCV-2在細(xì)胞中的增殖能力,弱化其致病性,這為研制 PCV-2疫苗提供了一個(gè)新的思路。

無致病性PCV-1和致病性PCV-2基因組的同源性為68%～76%,且均具有2個(gè)主要開放閱讀框ORF1與ORF2,分別編碼與復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白和構(gòu)成衣殼的Cap蛋白,ORF1基因比較保守,同源性為83%。Fenaux M 等[13]將PCV-2的 ORF2替換PCV-1的ORF2,成功構(gòu)建減毒的嵌合PCV-1和PCV-2,用 200μg嵌合病毒 DNA克隆及 103.5TCID50嵌合病毒分別免疫SPF仔豬,免疫后42 d,大部分免疫豬血清中PCV Cap蛋白抗體均發(fā)生陽轉(zhuǎn),在42 d用2×104.5TCID50 PCV-2野毒攻毒,21 d后在所有免疫豬均未檢查到病毒血癥,淋巴結(jié)腫大及衰竭明顯減輕,淋巴結(jié)中病毒DNA及抗原量較對(duì)照組顯著減少,且抗體陰性豬對(duì)PCV-2也具有相當(dāng)?shù)牡挚沽?表明細(xì)胞免疫在保護(hù)性免疫方面具有重要的作用。Gillespie J等[14]對(duì)嵌合病毒進(jìn)行2個(gè)氨基酸的標(biāo)志性突變后在PK-15細(xì)胞連續(xù)傳代11次,在豬體內(nèi)連續(xù)傳代3次,以鑒定其遺傳穩(wěn)定性,結(jié)果表明,在PK-15細(xì)胞傳代后,并未發(fā)生遺傳變異,而在豬體內(nèi)傳代時(shí),如果存在壓力,突變的氨基酸可能發(fā)生回復(fù)突變,不存在壓力則不發(fā)生突變。由此可見,嵌合病毒是一個(gè)很好的候選疫苗。PCV-2 ORF3是最近發(fā)現(xiàn)的基因,ORF3蛋白能誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡,與PCV-2的致病相關(guān),Karuppannan A K等[9]利用酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建了ORF3突變的重組PCV-2,接種斷奶仔豬后不引起明顯的臨床癥狀,與野毒相比,病毒血癥、淋巴結(jié)病理變化及抗原載量明顯減輕,且誘導(dǎo)了較強(qiáng)的抗體反應(yīng)及細(xì)胞免疫應(yīng)答,表明ORF3突變能顯著降低PCV-2的毒力,且突變病毒能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,是PCV-2疫苗研究的一個(gè)新方向。

3.4 病毒載體疫苗

3.4.1 腺病毒載體 腺病毒載體是目前應(yīng)用比較廣泛的載體,由于其宿主范圍廣、感染性強(qiáng)、安全性高、外源病毒能游離表達(dá)等特點(diǎn),用于制藥、基因工程疫苗、基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域。Wang X等[15-16]將PCV-2 ORF2克隆至轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV,構(gòu)建重組質(zhì)粒 pShuttle-CMV-ORF2,線性化pShuttle-CMV-ORF2與骨架載體pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染大腸埃希菌BJ5183獲得重組質(zhì)粒pAd-ORF2,線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞獲得重組腺病毒rA d-Cap。以108、1010、1012TCID50 rAd-Cap 免疫小鼠兩次 ,用間接ELISA、Western blot及病毒中和試驗(yàn)均可在免疫鼠血清中檢測(cè)到PCV-2ORF2抗體。用rAd-Cap兩次免疫仔豬,間隔兩周;首免后37 d,能檢測(cè)到ELISA抗體及病毒中和抗體;攻毒后,免疫豬有短暫的發(fā)熱,發(fā)熱時(shí)間較攻毒對(duì)照組短,無其他明顯的臨床癥狀。祝衛(wèi)國(guó)等[17]將ORF1、ORF2串聯(lián)構(gòu)建了同時(shí)含兩個(gè)基因的重組腺病毒,免疫小鼠可以誘導(dǎo)抗體免疫應(yīng)答?？梢?重組腺病毒免疫顯著減輕了免疫豬的病理變化及病毒血癥,是有效的PCV-2候選疫苗。

3.4.2 偽狂犬病毒載體 豬偽狂犬病毒(PRV)是豬偽狂犬病(PR)的病原,PRV病毒基因組為線性雙股DNA分子,約150 kb,至少包括70多個(gè)基因,其中含有大量的非必需基因,可以容納較大片段的其它病原體保護(hù)性抗原基因的插入表達(dá)。Ju C等[18]將PCV-2 Yu-A株的ORF1與ORF2基因串聯(lián)克隆入中間轉(zhuǎn)移載體,與PRV TK-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞,獲得重組偽狂犬病毒PRV-PCV-2,經(jīng)鑒定 PRV-PCV-2能有效表達(dá)ORF1-ORF2,用PRV-PCV-2免疫 Balb/c鼠后,誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的抗PRV與PCV-2的抗體反應(yīng),及PCV-2特異性的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),免疫斷奶仔豬后,誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的抗PRV的抗體反應(yīng),但對(duì)PCV-2僅誘導(dǎo)了特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)而無抗體反應(yīng)。Song Y等[19]通過將PCV-2 ORF2基因克隆到中間轉(zhuǎn)移載體且與PRV TK-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞構(gòu)建了能成功表達(dá)ORF2的重組偽狂犬病毒TK-/gE-/ORF2+,用該重組病毒免疫4周齡仔豬,可誘導(dǎo)對(duì)PRV與PCV-2的體液免疫反應(yīng),在免疫后49 d可以檢測(cè)到PCV-2特異性的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。

3.4.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒載體 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征的病原,可引起母豬懷孕后期流產(chǎn)及小豬的呼吸道疾病,為單股正鏈 RNA病毒,Pei Y等[20]在PRRSV cDNA克隆的ORFs 1b與2a插入兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)及一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列,將其改造成一個(gè)病毒載體,然后將PCV-2 ORF2基因插入兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)間,由插入的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)染 Marc-145細(xì)胞獲得了 P129-PCV重組PRRSV,兩次免疫仔豬,首免后3周內(nèi),母源抗體存在,抗體水平不斷下降,而二免后1周,免疫豬產(chǎn)生了PCV-2特異性的抗體應(yīng)答,結(jié)果表明PRRSV能成功表達(dá)豬其它病原的免疫原性蛋白,并誘發(fā)特異性的免疫反應(yīng),可以作為表達(dá)外來病原的豬疫苗載體。

3.4.4 桿狀病毒載體 桿狀病毒是一種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體,其基因組進(jìn)入細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)靶基因的瞬時(shí)表達(dá),該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、無毒性、宿主不產(chǎn)生抗桿狀病毒的抗體。Fan H等[21]將PCV-2 ORF2克隆入桿狀病毒基因組CMV啟動(dòng)子下游,轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后獲得重組桿狀病毒(BV-GORF2),Western blot及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明BV-G-ORF2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能有效表達(dá)Cap蛋白,且水皰性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)能增強(qiáng)病毒進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力,以 1×108或1×109PFU劑量免疫小鼠,能誘導(dǎo)PCV-2特異性ELISA抗體、中和抗體及細(xì)胞免疫反應(yīng),即使1×108PFU免疫,較表達(dá)Cap蛋白的DNA表現(xiàn)更強(qiáng)的免疫原性,結(jié)果表明,假型桿狀病毒可用于新一代PCV-2疫苗研究。

3.5 細(xì)菌載體疫苗

3.5.1 乳酸菌載體 乳酸菌在食品發(fā)酵業(yè)的應(yīng)用具有悠久歷史,是安全的口服細(xì)菌。以乳酸菌作為活疫苗載體,靶向表達(dá)醫(yī)用蛋白和抗原物質(zhì),已成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。Wang K等[22]將PCV-2 ORF2克隆入E.coli/L.lac分泌型穿梭表達(dá)載體pSEC:LEISS,構(gòu)建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap,電轉(zhuǎn)化乳酸菌NZ9000,獲得能有效表達(dá)Cap蛋白的重組乳酸桿菌NZ9000/pSEC:LEISS-dCap,該重組乳酸桿菌能耐受60 g/LN aCl濃度的高鹽環(huán)境和pH 1.5～4.5的胃液環(huán)境,在人工腸液中出現(xiàn)較明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì),但對(duì)膽酸鹽耐受力較差,以NZ9000/pSEC:LEISS-dCap培養(yǎng)液經(jīng)口灌喂對(duì)Balb/c小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育沒有影響,無毒性作用,能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗Cap蛋白的特異性IgG抗體,刺激腸道黏膜淋巴組織對(duì)其產(chǎn)生黏膜免疫。因此,NZ9000/pSEC:LEISS-dCap作為疫苗制品具有很大的應(yīng)用和開發(fā)潛力。

3.5.2 德特氏菌載體 支氣管炎博德特氏菌很容易在呼吸道黏膜定植,可能是一種比較好的能遞送異源蛋白至哺乳動(dòng)物甚至人呼吸道的活載體。Kim T等[23]將PCV-2的ORF2克隆至aro A突變的支氣管炎博德特氏菌獲得表達(dá)主要衣殼蛋白的重組博德特氏菌(BBS-MCP),然后用重組細(xì)菌鼻內(nèi)免疫小鼠和豬,用ELISA均可在血清中檢測(cè)到MCP的抗體,用PCV-2攻毒后,在活BBS-MCP免疫的豬淋巴結(jié)中檢測(cè)不到PCV-2 DNA,結(jié)果表明BBS-MCP免疫能有效抵抗PCV-2的感染,是發(fā)展抗PCV-2感染的減毒活疫苗的又一選擇。

3.6 類病毒粒子載體疫苗

類病毒粒子是一種非復(fù)制型的載體,主要由病毒的衣殼蛋白自我組裝而成,如細(xì)小病毒(PPV)的衣殼蛋白在表達(dá)后可以自我組裝形成類似PPV的顆粒。近年來,這種類病毒粒子用來攜帶其他病原的抗原表位而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,抵抗相應(yīng)的疾病,是一種新興的疫苗載體。Pan Q等[24]將PCV-2的抗原表位克隆到PPV VP2基因,VP2基因被克隆到腺病毒載體使其表達(dá)獲得雜合的類病毒粒子[PPV∶VLP-(PCV-2)],在沒有任何佐劑的條件下,PPV∶VLP-(PCV-2)較重組腺病毒表達(dá)的PCV-2 ORF2能誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答,可見 PPV∶V LP-(PCV-2)是可以預(yù)防PPV與PCV-2共感染的一種新興疫苗。

3.7 核酸疫苗

核酸疫苗因高效、持久、廣譜、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、無致病性等特點(diǎn),被作為一種新型的疫苗而得到廣泛的研究。將含PCV-2 ORF2基因的DNA疫苗載體免疫動(dòng)物后能誘導(dǎo)PCV-2抗體陽轉(zhuǎn)。為了增強(qiáng)PCV-2DNA疫苗的免疫效果,通常將免疫佐劑,如CpG基序[25],與PCV-2 ORF2共同克隆入DNA疫苗載體構(gòu)建DNA疫苗,結(jié)果表明免疫佐劑能一定程度地增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效應(yīng)。另外,將分別含ORF1、ORF2、ORF3的DNA載體聯(lián)合免疫可以增強(qiáng)免疫效果。A ravindaram K等[26]用p3224-ORF-1,-2和-3單獨(dú)或聯(lián)合免疫Balb/c小鼠2周后,用相應(yīng)的重組安哥拉牛痘病毒加強(qiáng)免疫,發(fā)現(xiàn)ORF-2/-3與ORF-1/-2/-3兩種組合免疫誘導(dǎo)的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF及PCV-2抗體水平均較其它免疫組高,盡管所有免疫組主要誘導(dǎo)體液免疫,而ORF-2/-3與ORF-1/-2/-3兩種組合免疫后的細(xì)胞免疫水平顯著高于其他組,攻毒后這兩種組合免疫顯著減輕了免疫鼠的肺部病變。Fan H等[27]通過構(gòu)建四種不同Cap蛋白定位的DNA疫苗載體探討了DNA疫苗免疫及Cap蛋白的定位對(duì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的影響,結(jié)果表明,四種DNA疫苗免疫均能誘導(dǎo)PCV-2特異性的體液免疫,但分泌型Cap蛋白較膜定位、核定位及胞質(zhì)Cap蛋白誘導(dǎo)更高的中和抗體,且降低了IFN-γ水平,而膜定位Cap蛋白則使IFN-γ升高,由于 IFN-γ能促進(jìn) PCV-2的復(fù)制,當(dāng)PCV-2感染時(shí),DNA疫苗免疫誘導(dǎo)的高水平IFN-γ存在潛在的危險(xiǎn),因此,表達(dá)分泌型 Cap蛋白的DNA疫苗是比較好的選擇。

4 小結(jié)

在北美及歐洲已有PCV-2滅活疫苗與亞單位疫苗注冊(cè)上市,這些疫苗對(duì)該地區(qū)PCV-2的控制發(fā)揮了巨大的作用。由于滅活疫苗用增殖能力低的PCV-2全病毒制備,表達(dá)亞單位Cap蛋白的桿狀病毒需用昂貴的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),因而這些疫苗的生產(chǎn)成本較高,而且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答主要為體液免疫,忽視了細(xì)胞免疫應(yīng)答在PCV-2保護(hù)免疫中的作用。減毒活病毒疫苗雖然能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,包括細(xì)胞免疫,但該疫苗的長(zhǎng)期使用存在返強(qiáng)的危險(xiǎn),且增殖能力較低。因此,尋找成本低、能充分誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫的活病毒載體或活細(xì)菌載體是目前研究的重點(diǎn),核酸疫苗也被廣泛的關(guān)注。我國(guó)現(xiàn)在沒有自主研發(fā)的疫苗注冊(cè),但已廣泛開展了PCV-2疫苗的研究工作,積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。相信隨著生物技術(shù)的發(fā)展及對(duì)PCV-2不斷深入了解,在不久的將來,我們一定能找到控制PCV-2的有效方法。

[1]Ramamoorthy S,Meng X J.Porcine circoviruses:aminuscule yetm amm oth paradox[J].Anim Health Res Rev,2009,10(1):1-20.

[2]祝衛(wèi)國(guó),黨如意,楊增岐,等.陜西7個(gè)地區(qū)豬2型圓環(huán)病毒(PCV 2)感染的血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2007,43(7):37-38.

[3]陳慶新.圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)分析及其突變體致病性[D].浙江杭州:浙江大學(xué)生物科學(xué)系,2006.

[4]Cheung A K.Rolling-circ le replication of an animal circovirus genom e in a theta-replicating bacterial plasmid in Escherichia co li[J].JV irol,2006,80(17):8686-8694.

[5]宋云峰.豬2型圓環(huán)病毒核酸疫苗及重組偽狂犬病毒二價(jià)基因工程疫苗的研究[D].湖北武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)系,2006.

[6]Stevenson L S,Gilpin D F,Doug las A,et al.T lymphocyte epitopem apping of procine circovirus type 2[J].V iral Immunol,2007,20(3):389-398.

[7]Shang S B,Jin Y L,Jiang X T,et al.Finem apping of antigenic epitopes on capsid p roteins of porcine circovirus,and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2[J].Mol Immunol,2009,46(3):327-334.

[8]Liu J,Zhu Y,Chen I,et al.TheORF3 protein of porcine circovirus type 2 interacts w ith porcine ubiquitin E3 ligase Pirh2 and facilitates p53 expression in viral infection[J].J V irol,2007,81(17):9560-9567.

[9]Karuppannan A K,Jong M H,Lee SH,et al.A ttenuation of porcine circovirus 2 in SPF piglets by abrogation of ORF3 function[J].V irology,2009,383(2):338-347.

[10]邢海云,趙建增,趙亞榮.豬2型圓環(huán)病毒疫苗的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2009,22(3):305-308.

[11]Fort M,Sibila M,Pérez-Martín E,et al.One dose ofa porcine circovirus 2(PCV 2)sub-unit vaccine administered to 3-w eek-old conventional piglets elicits cell-m ediated immunity and significan tly reduces PCV 2 virem ia in an experimental model[J].Vaccine,2009,27(30):4031-4037.

[12]Fenaux M,Opriessnig T,H albur PG,et al.Two amino acid mutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus(PCV-2)enhanced PCV-2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo[J].JV irol,2004,78(24):13440-13446.

[13]Fenaux M,Opriessnig T,H albur PG,etal.A chimeric porcine circovirus(PCV)with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type 2(PCV 2)cloned into the genom ic backbone of the nonpathogenic PCV 1 indu ces protective im-munity against PCV 2 infection in pigs[J].J Virol,2004,78(12):6297-6303.

[14]Gillespie J,Juhan N M,DiCristina J,etal.A genetically engineered chimeric vaccine against porcine circovirus type 2(PCV 2)isgenetically stab le in vitro and in vivo[J].Vaccine,2008,26(33):4231-4236.

[15]W ang X,JiangW,Jiang P,et al.Construction and immunogenicity of reconbinant andenovirusexpressing the cap sid protein of porcine circovirus(PCV 2)inm ice[J].Vaccine,2006,24(16):3374-3380.

[16]W ang X,Jiang P,Li Y,et al.Protection of pigs against post-weaning multisystemic wasting syndrome by a recombinant adinovirusexpressing the capsid p rotein of porcine circovirus type 2[J].Vet M icrobiol,2007,121(3-4):215-224.

[17]祝衛(wèi)國(guó),王旭榮,宋長(zhǎng)緒,等.豬Ⅱ型圓環(huán)病毒ORF1、ORF2基因串聯(lián)重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫效果[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,36(3):75-80.

[18]Ju C,Fan H,Tan Y,et al.Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2[J].Vet M icrobiol,2005,109(3-4):179-190.

[19]Song Y,Jin M,Zhang S,et al.Generation and immunogenicity of a recom binant pseudorabies virusexpressing cap protein of porcine circovirus type 2[J].Vet M icrobiol,2007,119(2-4):97-104.

[20]Pei Y,Hodgins D C,Wu J,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a vector:immunogenicity of g reen fluo rescent protein and porcine circovirus type 2 capsid ex pressed from dedicated subgenom ic RNAs[J].Virology,2009,389(1-2):91-99.

[21]Fan H,Pan Y,Fang L,et al.Constru ction and immunogenicity of recombinant p seudotype baculovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus type 2 in m ice[J].JV irol Methods,2008,150(1-2):21-26.

[22]Wang K,H uang L,Kong J,et al.Expression of the capsid protein of porcine circovirus type 2 in Lactococcus lactis for oral vaccination[J].JV irol Methods,2008,150(1-2):1-6.

[23]K im T,Toan N T,Seo J,et al.Bordetella bronchisep tica aroA mu tant as a live vaccine vehic le fo r heterologous porcine circovirus type 2major capsid protein expression[J].Vet M icrobiol,2009,138(3-4):318-324.

[24]Pan Q,H e K,H uang K.Develop of recombinant porcine parvovirus-like particles as an antigen carrier formed by the hyb rid VP2 protein carrying immuno reactive epitope of porcine circovirus type 2[J].Vaccine,2008,26(17):2119-2126.

[25]程凱慧,李俊,于周,等.含 CpG基序系列豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的構(gòu)建[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2008,38(12):1055-1059.

[26]A ravindaram1 K,Kuo T Y,Lan CW,et al.Protective immunity against porcine circovirus 2 in mice induced by a genebased combination vaccination[J].JGene M ed,2009,11(4):288-301.

[27]Fan H,Xiao S,Tong T,et al.Immunogenicity of porcine circovirus type 2 capsid p rotein targeting to differen t subcellular com partments[J].M ol Imm unol,2008,45(3):653-660.