許美梅 孔愛榮

(1泰山醫(yī)學(xué)院 山東泰安 271000，2聊城市人民醫(yī)院 山東聊城 252000)

在人類基因組中Eph是RTK家族最大的亞族，包括Eph受體及其ephrin配體。EPH是Hirai等[1]在人類cDNA文庫篩選病毒致瘤基因vfps同源序列時(shí)被首先發(fā)現(xiàn)的。他們克隆出該基因全部cDNA序列后，運(yùn)用Northern blot方法對(duì)一些人腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)該基因在一株產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素的人肝癌細(xì)胞系ETL-1中呈現(xiàn)高表達(dá)，故命名該新基因?yàn)镋PH(erythropoietin-producing human hepatocellular carcinoma)基因。Eph家族包括至少有14種受體和8種配體。EphB4是EPh受體中的一員，近年來的研究顯示EphB4/ephrinB2信號(hào)通路與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、生理病理性血管形成、腫瘤發(fā)展關(guān)系密切，成為國內(nèi)外腫瘤研究的熱點(diǎn)。

1 EphB4/ephrinB2的結(jié)構(gòu)

EphB4由胞外區(qū)、胞膜區(qū)與胞漿區(qū)組成。胞外區(qū)為配體結(jié)合區(qū),主要分布一個(gè)N端免疫球蛋白樣袢( immunoglobulin-like loop, IGLL)、一個(gè)半胱氨酸(cystein, Cys)富集區(qū)和兩個(gè)Ⅲ型纖維結(jié)合素( fibronectin typeⅢdomain, FNⅢ)重復(fù)區(qū)等結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)區(qū)為酪氨酸激酶的催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)控序列,主要分布酪氨酸激酶( tyrosine kinase, TK)結(jié)構(gòu)域、高度保守的SAM(sterile alphamoti,f SAM)結(jié)構(gòu)域和C端的PDZ(postsynaptic density protein, disc large, zona occludence, PDZ)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)等。

ephrinB2為單次跨膜蛋白(顯著特征是其高度保守的C端尾有5個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)C端PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序)，均包括信號(hào)區(qū)、結(jié)合區(qū)、間隔區(qū)和疏水區(qū)。EphrinB2的羧基末端由保守的酪氨酸殘基和PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序組成，可為包含SH2/SH3或PTB結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白提供結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)控制著配體的附著、受體與配體的集簇，調(diào)節(jié)受體與配體的結(jié)合，引起不同的生物反應(yīng)。

2 EphB4/ephrinB2間的信號(hào)傳導(dǎo)

Ephrins有別于其他的酪氨酸蛋白激酶受體(RTKs)的配體，它必須錨定在細(xì)胞膜上才能激活Eph受體。因而ephrinB2只有在膜附著狀態(tài)下才能有效激活EphB4,同樣EphB4也只有在膜附著狀態(tài)下才具有活性,因此EphB4與ephrinB2間相互作用是以細(xì)胞-細(xì)胞相互接觸進(jìn)行的。另外ephrins為跨膜分子,體外研究指出[2]EphB受體和ephrinB配體的相互作用可能導(dǎo)致受體與配體兩者同時(shí)發(fā)生酪氨酸磷酸化從而介導(dǎo)雙向的信號(hào)傳遞，即ephrinB2配體具有與受體類似的結(jié)構(gòu)兼具受體樣信號(hào)分子功能，一旦與EphB4受體結(jié)合其胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化,從而發(fā)生“反式”信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng),然而ephrinB磷酸化的誘導(dǎo)﹑與其連接的下游信號(hào)分子以及其生物學(xué)意義目前還不清楚。因此EphB4和配體ephrinB2間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是雙向的,兩者可互被對(duì)方激活,一般規(guī)律是ephrinB2激活EphB4為正向信號(hào),而EphB4激活ephrinB2為逆向信號(hào)。

3 EphB4/ephrinB2與血管形成

ephrinB2是近年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子。Wang等的研究中發(fā)現(xiàn)phrinB2在胚胎發(fā)育的早期特異性的標(biāo)記動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，而其受體EphB4在鼠胚及卵黃囊發(fā)育的全過程均標(biāo)記靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，EphB4與ephrinB2在內(nèi)皮細(xì)胞中的相互作用被認(rèn)為與接口處的動(dòng)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分界密切相關(guān)[3]?；蚯贸芯窟M(jìn)一步證實(shí)了EphB4/ephrinB2在血管發(fā)育中的作用，缺失EphB4和ephrinB2的突變小鼠，在胚胎發(fā)育的第11天(E11)死亡,表現(xiàn)出多種心血管系統(tǒng)缺陷。敲除ephrinB2的小鼠胚胎，其卵黃囊及頭部的血管生成過程被終止，始終停滯在原始毛細(xì)血管叢階段，動(dòng)脈與靜脈毛細(xì)血管床接口缺陷，管腔擴(kuò)張[3]。敲除EphB4的胚胎其產(chǎn)生的缺陷與此相似[4]，提示EphB4與ephrinB2在參與血管發(fā)生和血管生成過程中可能起著互補(bǔ)性作用。通過研究得知,內(nèi)皮細(xì)胞ephrinB2被激活所轉(zhuǎn)導(dǎo)的逆向信號(hào)可產(chǎn)生促內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移和促血管出芽等推動(dòng)性作用;而內(nèi)皮細(xì)胞EphB4被激活所轉(zhuǎn)導(dǎo)的正向信號(hào)產(chǎn)生抗內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移和抗血管出芽等排斥性作用[5，6]。正是EphB4/ephrinB2間的這種對(duì)抗性作用,指導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的導(dǎo)向及空間組合過程,正確形成動(dòng)靜脈血管的分化及動(dòng)脈性毛細(xì)血管與靜脈性毛細(xì)血管的分界。

4 EphB4/ephrinB2在惡性腫瘤中的表達(dá)

惡性腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移是多基因、多因子共同作用的結(jié)果,涉及到多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。作為蛋白酪氨酸激酶受體家族中最大的一個(gè)亞家族,Eph受體及其配體ephrin在腫瘤發(fā)生和演進(jìn)中的作用受到廣泛的關(guān)注,特別是eprinB2和EphB4在惡性腫瘤中的表達(dá)及相互作用成為近幾年國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 Noren等[7]研究顯示EphB4和EphrinB2可能在腫瘤的血管生成過程有重要作用。在許多腫瘤組織中EphB4和EphrinB2也存在著擴(kuò)增和過表達(dá),在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中亦肯能有重要作用。研究表明,在肺癌、骨肉瘤、胃癌等腫瘤組織中EphB4和EphrinB2表達(dá)均高于相應(yīng)的正常組織。Uttam等[8]發(fā)現(xiàn)EphB4在所有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)本和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)都有表達(dá),EphB4的蛋白表達(dá)水平和基因擴(kuò)增在腫瘤的低分化(Ⅲ或Ⅳ)高于高分化(Ⅰ或Ⅱ),同時(shí)PT-PCR也證實(shí)了在腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)EphB 4基因擴(kuò)增,低分化腫瘤(Ⅲ或Ⅳ)EphB 4基因擴(kuò)增高于高分化(Ⅰ或Ⅱ)。另外EphB4 的異常表達(dá)見于結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、惡性間皮瘤等[9- 12]。與正常間皮細(xì)胞相比, EphB4 的高表達(dá)于惡性間皮瘤細(xì)胞系及原發(fā)的腫瘤組織, 并且應(yīng)用siRNA 技術(shù)和反義寡核苷酸技術(shù)來下調(diào)EphB4 的表達(dá), 會(huì)引caspase-8 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡, 抗凋亡蛋白如bcl-xl 水平下降, 并且減少Akt 的磷酸化, 下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2 的轉(zhuǎn)錄, 減少腫瘤細(xì)胞的存活力, 降低侵襲和轉(zhuǎn)移能力[12]。目前文獻(xiàn)關(guān)于ephrinB2是否在腫瘤中呈高表達(dá)的結(jié)論不一,一些研究發(fā)現(xiàn)ephrinB2在腫瘤組織和正常組織之間表達(dá)相似,另一些研究則發(fā)現(xiàn)ephrinB2在腫瘤組織表達(dá)升高,如Tachibana等[13]發(fā)現(xiàn)ephrinB2在食管癌和瘤周正常粘膜組織之間表達(dá)相似,但和腫瘤進(jìn)展、不良預(yù)后有關(guān)。

5 Eph/ephrin與惡性腫瘤的臨床關(guān)系及應(yīng)用

惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方法是外科手術(shù)及術(shù)后的放化療，但其預(yù)后并不是很理想。近年來對(duì)惡相腫瘤的治療目標(biāo)轉(zhuǎn)移到控制腫瘤血管的生成，從而抑制其生長和轉(zhuǎn)移。其潛在的目標(biāo)是控制血管生成，以此降低腫瘤負(fù)荷和提高生存率。RTKs中的3個(gè)家族的受體和配體與血管的生成有關(guān)，包括VEGF, 促血管生成素和ephrins/Ephs家族。其中EphB4及其配體ephrinB2在腫瘤血管生成中的作用尤為得到關(guān)注。有研究[14]報(bào)道，在胚胎組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)中，OP9骨髓基質(zhì)細(xì)胞能夠抑制表達(dá)ephrinB2的內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)展，促進(jìn)過表達(dá)EphB4的動(dòng)靜脈血管內(nèi)皮的發(fā)展。在皮下移植的B16黑色素腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的EphB4可抑制腫瘤的生長?；谶@些研究，有學(xué)者推斷EphB4在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)可通過ephrinB2的反向信號(hào)抑制腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮的生存。研究顯示經(jīng)由ephrinB2發(fā)出的反響信號(hào)能抑制ephrinB2表達(dá)陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)。因此得出雙向信號(hào)影響了動(dòng)靜脈界限的形成。反響信號(hào)可能終止新生血管的形成或使成熟血管修復(fù)。Higinio等[15]用動(dòng)物模型來研究EphB4在腸道腫瘤中的作用。通過調(diào)節(jié)EphB4在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的水平可以觀察到腫瘤細(xì)胞的生長速度有明顯的差異，即EphB4表達(dá)水平低時(shí)腫瘤生長較慢。基因分析顯示EphB4基因的突變導(dǎo)致基底膜的重組，影響了細(xì)胞增殖基因，重塑了細(xì)胞外的細(xì)胞體系，和細(xì)胞黏附在基底膜，其中包括基因官能團(tuán)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，EphB4缺失較大的增加了結(jié)腸癌細(xì)胞向細(xì)胞基質(zhì)的侵襲力。總的來說，EphB4有腫瘤抑制基因的作用。Xia等[12]報(bào)道利用RNA干擾或反義寡核苷酸技術(shù)敲除EphB4編碼的癌蛋白,使腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲受到明顯抑制并誘導(dǎo)凋亡,這表明EphB4基因可以直接或間接參與腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控過程。研究發(fā)現(xiàn), EphB4的失調(diào)能導(dǎo)致細(xì)胞無限制的生長,并導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。EphB4促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的芽生、遷移、增殖和管腔形成，還可能在腫瘤血管生成過程中起重要作用。

6 結(jié) 語

EphB4及其配體ephrinB2在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤血管的生成密切相關(guān)，在惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用。通過調(diào)節(jié)EphB4/ephrinB2的表達(dá)水平從而抑·制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,同時(shí)抑制血管形成,雙重打擊腫瘤生長。提示EphB4、ephrinB2有望成為腫瘤治療中新穎的雙重靶點(diǎn)。

[1] Hirai H,Maru Y,Hagiwara K,et al.A novel putative tyrosine kinase receptor encoded by the eph gene[J].Science, 1987,238(4834):17-20.

[2] Bruckner K,Klein R. Signaling by Eph receptors and their ephrin ligands[J].Curr opin Neurobiol,1998,8:375-382.

[3] Wang HU, Chen Z-F, Anderson DJ.Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins reveaoled by ephrinB2 and its receptor EphB4[J].Cell,1998, 93:741-753.

[4] Gerety SS,Wang HU,Chen ZF,et al.Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrinB2 in cardiovascular development[J].Mol Cell,1999, 4:403-414.

[5] FullerT, KorffT, Kilian A, et al. Forward EphB4 signaling in endothelial cells controls cellular repulsion and segregation from ephrinB2 positive cells[J].JCellSci, 2003, 116(Pt12): 2461-2470.

[6] HamadaK, OikeY, ItoY, eta.l Distinct roles of ephrinB2 forward and EphB4 reverse signaling in endothelial cells[J].Arterioscler Thromb VascBiol,2003, 23(2): 190-197.

[7] Noren NK.Lu M,Freeman AL.etal. Interplay between EphB4 on tumor cells and vascular ephrin-B2 regulates tumor growth[J].PNAS, 2004, 101(15): 5583.

[8] Uttam K,Sinha MD,Kashif Mazhar MD,etal.The Association Between Elevaed EphB4 Expression, Smoking Status, and Advanced-Stage Disease in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma[J].Arch otolaryngol head neck sury, 2006, 132 (10):1053-1059.

[9] Meyer S, Hafner C, Guba M, et al.Ephrin- B2 overexpression enhances integrin - mediated ECM- attachment and migration of B16 melanoma cells[J]. Int J Oncol,2005, 27(5):1197- 206.

[10] Berclaz G, Karamitopoulou E, Mazzucchelli L, et al. Activation of the receptor protein tyrosine kinase EphB4 in endometrial hyperplasia and endometrial carcinoma[J]. Ann Oncol, 2003,14(2):220- 226.

[11] Xia G, Kumar S R, Masood R, et al. EphB4 expression and biological significance in prostate cancer[J]. Cancer Res, 2005, 65(11):4623- 4632.

[12] Xia G, Kumar S R, Masood R, et al. Up- regulation of EphB4 in mesothelioma and its biological significance[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(12):4305- 4315

[13] TachibanaM, TonomotoY, HyakudomiR, et a.l Expression and prognostic significance of EFNB2 and EphB4 genes in patientswith oesophageal squamous cell carcinoma[J]. DigLiverDis, 2007, 39 (8): 725-732.

[14] Xiaoyong Huang, Yoshihiro Yamada, Hiroyasu Kidoya, et a.l EphB4 Overexpression in B16 Melanoma Cells Affects Arterial-Venous Patterning in Tumor Angiogenesis[J]. Cancer Research 67, 9800, October 15, 2007. doi: 10.1158/0008-5472.

[15] Higinio Dopeso, Silvia Mateo-Lozano, Rocco Mazzolini, The Receptor Tyrosine Kinase EPHB4 Has Tumor Suppressor Activities in Intestinal Tumorigenesis[J].Cancer Research 69, 7430, 2009;doi:10.1158/0008-5472.