陳繼承，盧曉鳳，何國慶*

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

降血脂功效成分體外篩選方法研究進展

陳繼承，盧曉鳳，何國慶*

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

高通量降血脂活性成分篩選為高脂血癥治療藥物和保健品開發(fā)提供了便捷通道。本文從受體篩選模型、膽固醇代謝篩選模型、模擬膽汁膠束法和脂質代謝調控酶的抑制劑方面，對近年來國內外降血脂成分體外篩選方法進行了介紹，為降血脂活性成分的篩選研究提供參考。

高脂血；膽固醇；降血脂；體外篩選方法

Abstract：Abnormal lipid metabolism is one of risk factors for atherosclerotic cardiovascular disease. The commonly used hypolipidemic drugs have toxicity to some extents. Screening effective, non-toxic, natural hypolipidemic ingredients has become one of hot topics in the fields of modern medicine, nutrition and biotechnology at home and abroad. Animal models with hyperlipidemia were high cost, time-consuming and unsuitable for high throughput screening. A convenient strategy for developing hypolipidemic drugs and health foods is to screen bioactive componentsin vitro. In this paper, screening methods for hypolipidemic drugsin vitrohave been reviewed, which will provide references for further research of hypolipidemic components.

Key words：hyperlipemia；cholesterol；hypolipidemic；screening methodsin vitro

血脂是血漿中甘油三酯、膽固醇等中性脂肪和磷脂、糖脂、固醇、類固醇等類脂的總稱。高脂血癥屬體內血脂代謝異常所致，因血脂過高誘發(fā)的動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等心腦血管疾病已嚴重威脅人類健康。血脂高低與日常膳食攝入和體內代謝有著密切關系。降血脂功效成分篩選和降血脂藥物開發(fā)的相關研究備受學術界關注，國內外學者對降血脂藥物的篩選靶標及體外篩選方法進行了廣泛研究和探討。不同降脂成分篩選方法基于不同降脂途徑，主要包括增加降脂因子的表達和促進脂質代謝和排泄、抑制外源性脂類吸收、減少內源性脂質合成等途徑。本文分類概述近年來降血脂功效成分體外篩選方法研究進展，旨在為降血脂活性成分的篩選研究提供參考。

1 受體篩選模型

受體是調脂藥物治療重要靶標之一，基于受體可以建立降血脂成分高通量快速檢測平臺。尋找調控脂質代謝相關的受體，篩選其相關受體激動劑或阻斷劑是脂質代謝研究的新方向。篩選模型可以對這些基因調控元件進行表達調控，以熒光素酶基因為報告基因，最終通過檢測熒光素酶的表達量間接反映降血脂效果。目前研究較多的受體主要有蛋白受體和核受體。

1.1 低密度脂蛋白受體(LDLR)

LDLR在調節(jié)LDL代謝和保持血液中膽固醇正常濃度方面起著非常重要的作用。通過激活LDLR基因的表達來吸收血液中的LDL是一種降低血液LDL濃度的途徑。以控制LDLR基因表達的血清反應元件為靶位點，構建LDLR啟動子熒光素酶報告基因質粒，將此質粒轉染人肝癌細胞系等可構建LDLR報告基因模型。張華等[1]利用LDLR 報告基因系統(tǒng)，從微生物發(fā)酵產物中篩選獲得一種降脂藥物。這種篩選方法在瀉澤、姜黃、決明子等傳統(tǒng)中藥的降血脂成分篩選方面也有應用。

1.2 巨噬細胞清道夫受體(SR)

變性的LDL被公認為是導致動脈粥樣硬化(AS)的危險因子。SR具有廣泛的配體活性，能與修飾脂蛋白乙?；脱趸腖DL高親和性結合，是形成泡沫的主要原因。以人清道夫受體CD36或者受體A等為靶點，構建受體拮抗劑高通量篩選細胞模型，利用該模型對化合物樣品或者微生物發(fā)酵提取物進行篩選可以獲得陽性化合物，可能成為治療AS的藥物先導化合物[2]。Chen等[3]以SR-A的胞漿域為靶點，通過篩選噬菌體隨機多肽庫，得到一種與SR-A胞漿域特異性結合的多肽，可以抑制誘導分化的THP-1細胞結合攝取乙?；鞍?。

1.3 核受體

核受體是配體依賴性轉錄因子超家族，可通俗理解為一種關閉和開啟基因的蛋白。與脂質代謝相關的核受體有過氧化物體增殖因子激活受體(PPAR)、肝臟X受體(LXR)、類法尼醇X受體(FXR)，每種核受體各自又有不同的亞型且功能各異。利用哺乳動物細胞核受體的配體結合域與含有GAL4基因的結合域連接構成融合表達載體，與含有GAL4結合序列的報告質粒共轉染動物細胞，可通過測定熒光素酶的表達量，評價和篩選核受體的激動劑。

大量研究證實PPAR在體內參與多種能量代謝及細胞活性物質的調節(jié)過程，具有改善糖脂代謝作用。激活的PPARα可誘導脂蛋白酯酶表達，促進血脂中的甘油三酯水解；誘導轉運蛋白和乙酰輔酶A合成酶表達；促進肝臟攝取脂肪酸、抑制肝臟合成甘油三酯；誘導肝細胞ApoAⅠ和ApoAⅡ基因表達，增加HDL及促進膽固醇逆轉運等。降脂藥Wy14643、西普洛貝特(ciprofibrate)、氯貝特(clofibrate)、GW2331、ETYA 等都是PPARα的激活劑。PPARγ的超生理活化可誘導乙酰輔酶A合成酶、脂肪酸轉運蛋白、LPL和脂肪酸結合蛋白的表達增加，使轉運至肌肉和肝臟的脂肪酸減少，脂肪合成降低[4]。胰島素增敏劑噻唑烷酮類(TZDs)、西普洛貝特等則是PPARγ的激活劑。PPARβ/δ激動劑可以增加胰島素抵抗和肥胖動物的血漿HDL濃度。英國葛蘭素威康公司開發(fā)的GW 2433，是人類PPARδ的高親和配體，為PPARδ、PPARα雙重激動劑[5]。苯扎貝特(bezafibrate)也是PPARδ的激活劑。PPARα和PPARγ是通過誘導LXRα的表達增加，間接誘導ABCA1 的表達；PPARβ/δ活化物誘導ABCA1 表達的分子機制可能不依賴于LXRα。

LXR作為中心調節(jié)子參與膽固醇和脂質代謝中有關基因調控，其調控的基因包括參與膽固醇流出的ABC轉運子，高密度脂蛋白(HDL)調節(jié)蛋白和調節(jié)膽固醇分泌到膽汁中的基因。FXR是膽汁酸的傳感器，可以調節(jié)機體膽酸水平的相對恒定，可使機體免受膽汁酸濃度過高造成的損害。美國Howard Hughes醫(yī)學研究中心發(fā)現(xiàn)向老鼠體內注射LXR受體和FXR受體，并伺喂LG268藥物，能夠顯著阻止細胞對膽固醇的吸收。人工合成的GW396和T0901317是LXR激動劑，可抑制人類肝細胞中白介素-1β/白介素-6誘導的C反應蛋白mRNA及蛋白水平表達，預防動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展[6]。

2 膽固醇代謝篩選模型

2.1 降低細胞中膽固醇含量

細胞內膽固醇的流出對維持細胞膽固醇平衡、促進膽固醇逆轉運及抗動脈粥樣硬化都起著非常重要的作用。以血管平滑肌細胞源性荷脂細胞為模型，不同濃度及時間姜黃素處理細胞，高效液相色譜分析法檢測細胞內總膽固醇[7]。結果表明，姜黃素可降低胞內總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯含量，且這種作用跟固醇調節(jié)元件結合蛋白Ⅰ的表達上調有一定關系。以3T3-L1脂肪細胞為模型[8]，給予不同濃度的煙酸干預后，收集細胞，采用液體閃爍計數(shù)器檢測細胞內膽固醇流出。結果表明，煙酸可加速細胞內膽固醇流出，降低細胞內膽固醇含量。張露等[9]研究了銀杏葉提取物GBE50對培養(yǎng)細胞內膽固醇代謝的影響，采用膽固醇氧化酶終點法檢測GBE50對培養(yǎng)細胞HepG2、HUVEC、SH-SY5Y總膽固醇含量的影響。結果表明，GBE50可有效降低部分培養(yǎng)細胞內總膽固醇的含量。

2.2 阻止膽固醇的吸收

Caco-2細胞模型已經成為一種預測藥物人體小腸吸收以及研究藥物轉運機制的標準體外篩選工具。體外人結腸腺癌(Caco-2)細胞系法，可應用于多類藥物研究，幫助了解藥物的吸收機制，預測體內吸收和藥物相互作用，研究藥物的小腸代謝情況，從而促進新藥研發(fā)。向處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞添加含有藥物和14C同位素標記的膽固醇膠束溶液，共培養(yǎng)后裂解細胞，放射定量檢測細胞中膽固醇的含量；計算加藥物處理與未處理細胞中膽固醇含量的比值。Nagaoka等[10-11]報道了β-乳球蛋白肽對Caco-2細胞膽固醇吸收的影響，胰蛋白酶水解后的β-乳球蛋白多肽Ile-Ile-Ala-Glu-Lys可以明顯降低Caco-2細胞對膽固醇的吸收。van Heek等[12]發(fā)現(xiàn)Ezetimibe可以選擇性的抑制小腸上皮細胞對于膽固醇的吸收。

3 模擬膽汁膠束法

3.1 膽汁酸結合

腸道中的膽汁酸經過內部循環(huán)，阻斷肝膽循環(huán)，結合膽汁可使肝臟中的膽固醇減少。膽汁酸結合能力測定：適量樣品溶于?；悄懰猁}緩沖溶液，振蕩搖勻后37℃孵育[13]，然后室溫下透析，檢測透析液中?；悄懰猁}的含量，計算樣品膽汁結合能力。考來烯胺(消膽胺)和考來替泊(降膽寧)為堿性陰離子交換樹脂，在腸道與膽汁酸形成絡合物隨糞排出，故能阻斷膽汁酸的重吸收，影響膽固醇吸收。因此具有膽汁酸結合能力的物質，具有一定的降血脂活性。

3.2 膽固醇吸收抑制

膽固醇只有溶于混合膠束，才會被運至小腸絨毛進行吸收，因此其溶于膠束是膽固醇吸收的關鍵。植物甾醇、活性多肽、活性多糖類物質能降低膽固醇在油相和膠束相中的溶解度，與膽固醇競爭進入膽鹽膠束，競爭混合膠束的空間并取代膽固醇，干擾其吸收。體外模擬人體的腸道，用超聲波乳化的方法制備出一種人造膽汁膠束溶液。此方法可以對這類降血脂活性物質進行篩選。Nagaoka等[14]從β-乳球蛋白水解產物中分離純化得到了第一條降血脂多肽(IIAEK)。Zhong等[15]先后采用此方法進行了大豆降膽固醇活性肽的分離純化，并分離到了具有顯著降低膽固醇活性肽組分Try-Gly-Ala-Pro-Ser-Leu。此法不足之處是樣品需要量在毫克級，不利于高通量篩選方法的建立。

4 脂質代謝調控酶的抑制劑

研究較多的參與脂質代謝的酶與蛋白質主要有脂蛋白脂肪酶、肝脂酶、卵磷脂膽固醇酰基轉移酶、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶、膽固醇酯轉移蛋白等。

4.1 HMG-CoA還原酶抑制劑

HMG-CoA還原酶是體內催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成二羥甲基戊酸(MVA)的關鍵酶，這一步是體內合成膽固醇的限速步驟，也是目前最主要的高血脂癥臨床藥物的靶點。HMG-CoA還原酶抑制劑是降血脂功效成分和藥物篩選主要手段之一。

目前，抑制劑對HMG-CoA還原酶抑制活性的研究方法主要有：1)分光光度法。從豬肝中提取HMG-CoA還原酶，以NADPH、Cysteamine為底物，于波長339nm處測定NADPH光吸收的下降可代表酶活力大小及反應速度。但是此法反應條件難以控制，背景干擾無法去除，會造成測定結果的不準確；2)同位素標記法。如以[14C]-乙酸、D,L-[14C]HMG-CoA或D,L[14C]-甲羥戊酸作為底物，反應后測定形成的固醇中同位素的摻入率，可計算出樣品抑制固醇脂質合成能力[16]。方法簡便、不需分離步驟，且靈敏度高，定位定量準確，但對實驗人員要求較高；3)薄層層析法。胡海峰等[17]建立了體外酶反應系統(tǒng)，以HMG-CoA還原酶抑制劑美伐他汀為陽性對照，使用TLC分析膽固醇合成量，篩選真菌次級代謝產物。其他分離方法如紙層析法和柱層析法，同樣可以有效地將底物與產物分離；4)液相色譜法。通過檢測反應體系中NADPH濃度的變化，測定HMG-CoA還原酶抑制劑活性[18]。不過由于反應體系只有100μL，容易引起操作誤差。

另外，人們已從微生物代謝產物中發(fā)現(xiàn)了角鯊烯合成酶抑制劑，不僅能降低血漿膽固醇水平，還能降低血漿甘油三酯水平[19]，而且對類異戊二烯的合成沒有影響。角鯊烯合成酶抑制劑的研究也已成為降血脂藥物研制的一個重要方向。

4.2 脂肪分解與合成酶抑制劑

4.2.1 脂肪酶抑制劑

脂肪酶抑制劑篩選已成為降血脂和減肥藥物篩選的重要方向。脂肪酶抑制劑篩選過程中酶活測定方法和脂肪酶、底物的選擇都非常重要。穩(wěn)定的脂肪酶活性測定方法是其抑制劑篩選的關鍵。目前，脂肪酶活性測定的方法很多，尚無統(tǒng)一標準。常用的脂肪酶水解底物有1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸試靈酯、對硝基苯酚棕櫚酸酯、三油酸甘油酯、橄欖油，以及其他油類如蘇籽油、亞麻油、魚油、月見草油等。Umezawa等[20]從Streptomyces lavendulaeMD4-Cl的發(fā)酵液中純化得到了一種強效胰酯酶抑制劑esterastin，其IC50為0.36μmol/L。Weibel等[21]從Streptomyces toxytricini分離到了胰脂酶抑制劑lipstatin，其IC50為0.14μmol/L，對其他的胰酶如磷脂酶A2和胰蛋白酶活性基本沒有影響。羅氏公司又將Lipstatin氫化還原衍生為更穩(wěn)定的orlistat，并被FDA批準為抗肥胖藥。臨床研究表明orlistat具有顯著的降血脂和減肥效果[22-23]，它們的作用機制為通過與胃、胰脂肪酶活性部位的絲氨酸殘基共價結合而使其失活，抑制甘油三酯水解，并使單甘酯和游離脂肪酸的攝入減少。Takahashi[24]申報了脫脂大米胚芽中提取脂肪酶抑制劑的美國專利。

4.2.2 脂肪酸合成酶(FAS)抑制劑

脂肪酸合成酶為維持食物攝入和能量消耗之間合適的平衡點提供了很好的調節(jié)靶位。淺藍菌素(cerulenin)作為第一個脂肪酸合成酶抑制劑，可以與脂肪酶共價結合形成復合物，是FAS的非競爭性抑制劑。Loftus等[25]以淺藍菌素為模板合成了C75，腹腔注射C75(15mg/kg)對內源性脂肪酸合成酶抑制率達95%，丙二酰輔酶A濃度增加了110%。在外周，它可以增加CPT-1活性，通過加速脂肪酸的氧化來加快能量消耗進程。綠茶中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)也對FAS有抑制作用。

4.3 ?；o酶A-膽固醇?；D移酶(ACAT)抑制劑

?；o酶A-膽固醇?；D移酶(ACAT)抑制劑可抑制體內小腸、肝臟及動脈的ACAT，降低血漿總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平，同時阻止膽固醇酯化，減少膽固醇在動脈壁的蓄積，防止動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展。ACAT對膽固醇的吸收、VLDL的形成及膽固醇在動脈粥樣硬化病變中的蓄積起著關鍵性作用。從20世紀80年代后期已開始從微生物代謝產物中篩選ACAT抑制劑，其研究主要集中在日本，產生菌有青霉、煙曲霉、粘帚霉、鐮孢霉等。微粒體ACAT活性的測定[26]，應用14C標記的游離膽固醇，以大鼠肝微粒體作為酶的來源。測定油酸轉化成它的CoA酯及隨后酯化成游離膽固醇過程中兩個酶學反應的產物活性。Tomoda等[27]從Pencillium purpurgenum的代謝產物中發(fā)現(xiàn)ACAT抑制劑。Fukuda等[28]從苦丁茶中分離到單萜苷類化合物活性較高，IC50為0.269μmol/L。Nishimura等[29]分離到三萜類化合物，其ACAT抑制活性很強，IC50為0.044μmol/L。

4.4 膽固醇代謝調控關鍵蛋白抑制劑

Cao等[30]研究組報道了調節(jié)膽固醇代謝的新機制，發(fā)現(xiàn)新的膽固醇代謝調控關鍵蛋白——gp78結合蛋白Ufd1，并發(fā)現(xiàn)Ufd1蛋白與gp78蛋白的結合增強了gp78的泛素連接酶活性，加速膽固醇合成代謝的關鍵酶——羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的降解，進而增強細胞對低密度脂蛋白的吸收，降低血液膽固醇水平。Altmann等[31]通過染色體生物信息系統(tǒng)證實了藥物的分子學機制，其作用靶點是膽固醇吸收蛋白(Niemann Pick C1 like 1，NPC1L1)，其氨基酸結構有42%與Niemann Pick C1型蛋白 (NPC1)相同。膽固醇吸收蛋白目前已被證實為膽固醇濃度最主要的調節(jié)因子[32]，機制可能是通過細胞核的膽固醇感受器LXR，其在調節(jié)細胞內膽固醇、脂肪酸、葡萄糖的動態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用，主要表達在肝臟、小腸、腎臟、脂肪等器官和組織[33-34]。Ge等[35]報道了在肝臟和小腸細胞中，NPC1L1控制膽固醇在細胞表面和細胞內循環(huán)轉運，并鑒定出這個過程依賴于細胞內的微絲系統(tǒng)和Clathrin/AP2蛋白復合體。他們進一步闡明了新近上市的降膽固醇藥物Ezetimibe的作用機制，證明該藥物通過抑制NPC1L1蛋白，從而抑制細胞對膽固醇的吸收。這些研究都為尋找更加有效的新型降膽固醇藥物提供了靶點和研究基礎。另外微粒體甘油三酯(MTP)抑制劑和固醇斷裂活化蛋白(SCAP)配體的研究也在進行中。

膽固醇酯轉運蛋白(CETP)是膽固醇逆向轉運過程中的關鍵酶之一。在CETP介導下，HDL中的膽固醇酯與LDL和VLDL的TG相互交換，調節(jié)血漿HDL水平、組成和顆粒大小，提高血漿HDL-C水平。鑒于CETP缺陷可提高HDL-C水平，研發(fā)CETP抑制劑給人們帶來了新的希望。

5 結 論

血脂水平與機體脂質合成和代謝的平衡有關。現(xiàn)有方法可從脂肪/膽固醇的幾個不同代謝途徑考察藥物降脂功效，達到降脂成分初步篩選目的。但所獲結果較單一，較難全面反映藥物在體內的具體功效。不同篩選途徑相互結合、多靶點綜合考慮是降血脂功效成分篩選的趨勢。同時基于降脂新機制、作用新靶點的篩選方法正在不斷的研究和完善。20世紀降脂研究主要集中在脂質代謝調控酶的抑制劑篩選方面，目前降血脂臨床藥物大多是酶抑制劑類。近年來，核受體調節(jié)脂質代謝的研究已成為國內外研究的新熱點，核受體能調節(jié)大量與脂質代謝相關的靶基因，對膽固醇、脂肪酸、脂蛋白等物質的代謝過程有重要的調節(jié)作用。目前已利用分子生物學手段構建了高通量的篩選方法，部分篩選到的核受體激動劑已成為臨床藥物，并顯現(xiàn)出其在治療脂質代謝紊亂相關疾病的潛在優(yōu)勢和重大意義。

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Research Progress of Screening Methods for Hypolipidemic Componentsin vitro

CHEN Ji-cheng，LU Xiao-feng，HE Guo-qing*
(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

TS201.4

A

1002-6630(2010)13-0287-05

2009-12-30

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD27B09)

陳繼承(1978—)，男，博士研究生，研究方向為發(fā)酵工程及降血脂功能性食品開發(fā)。E-mail：newtaicjc@163.com

*通信作者：何國慶(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程、食品生物技術。E-mail：gqhe@zju.edu.cn