葉 帥 瞿明仁 游金明 王自蕊 黎觀紅 丁君輝

（江西農業(yè)大學動物科技學院,南昌 330045）

豬的宮內生長受限（intrauterine grow th retardation,IUGR）（或發(fā)育遲緩）是妊娠母豬在缺乏營養(yǎng)、缺氧、藥物刺激或胎盤功能不足等情況下引起胚胎原有的發(fā)育路線發(fā)生改變,以至于造成胎兒發(fā)育緩慢,新生仔豬體重偏小、健康狀況較差及成活率下降的一種復雜生理現象。在養(yǎng)豬生產中,IUGR不僅是母豬產弱胎、死胎和畸形胎的一個主要原因,而且是仔豬出生后生長受阻、飼料轉化效率下降的一個重要原因[1-2]。對于集約化飼養(yǎng)的豬只來說,IUGR多由母豬孕期（尤其是孕中、后期）胎盤運輸能力的低下和功能的缺失所引起[2]。由于精氨酸經一氧化氮合酶（NOS）催化后生成的氣態(tài)信號分子一氧化氮（NO）可以促進血管內皮生長因子（VEGF）的分泌,并對血管的擴張起著舉足輕重的作用,而胎兒的營養(yǎng)又主要依靠胎盤的血管運輸,這就意味著胎盤血流可能受到NO的直接調節(jié)作用和精氨酸的間接調節(jié)作用。因此,通過精氨酸的NO信號通路干預胎盤血流就成了調節(jié)胎兒營養(yǎng)供給、預防或改善仔豬發(fā)生IUGR的理想途徑。目前,用1.0%精氨酸提高母豬繁殖性能的研究[2]已有報道,但能揭示其機理的研究還有待于進一步深入。本研究通過NOS抑制劑——左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）刺激妊娠母豬誘導IUGR的發(fā)生,同時以NO通路為主線,探討精氨酸對豬宮內受限的調節(jié)作用,從而為提高母豬的繁殖性能和提高胎兒的生長發(fā)育奠定理論基礎,為減少IUGR給我國養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大損失提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用L-精氨酸（L-A rg）為L-精氨酸鹽酸鹽（L-A rg?HCl）,由日本味之素株式會社公司提供,產品純度為99.0%,L-精氨酸實際含量為81.8%;丙氨酸購自河北省冀州市華陽化工有限公司,純度≥98.5%;L-NAME購自美國Sigm a公司,純度≥98.0%,使用時按預試驗確定的15.0 m g/kg BW注射劑量準確稱取一定質量的LNAME溶解于2.5 m L滅菌蒸餾水中配成LNAME溶液。豬血清NO、總一氧化氮合酶（TNOS）及VEGF試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗動物與分組設計

選取胎次（2～4胎）、膘情和預產期相近,健康狀況良好的長白×大約克夏妊娠母豬40頭,隨機分為4個處理:處理Ⅰ（正對照）、處理Ⅱ（L-NAME,負對照）、處理Ⅲ（L-NAME+1.0%L-A rg）、處理Ⅳ（1.0%L-A rg）,每個處理10個重復,每個重復1頭母豬。自孕85 d開始,連續(xù)21 d對處理Ⅱ、Ⅲ母豬于頸背部皮下多點注射2.5 m LL-NAME溶液,每天（09:00～10:00）1次,每次劑量為15.0 mg/kg BW。處理Ⅰ和Ⅳ母豬則以相同方式注射等體積的生理鹽水。

1.3 試驗飼糧及營養(yǎng)水平

妊娠母豬試驗飼糧參照NRC（1998）推薦的營養(yǎng)標準并做適當調整而配制。處理Ⅰ、Ⅱ飼糧為玉米-豆粕型基礎飼糧中添加1.7%丙氨酸（等氮處理）;處理Ⅲ、Ⅳ飼糧為在基礎飼糧中添加1.0%L-精氨酸鹽酸鹽。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（飼喂基礎）Tab le 1 Composition and nutrient levels o f diets（as-fed basis,%）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在廣東旺大集團南昌試驗豬場執(zhí)行。妊娠母豬單欄飼養(yǎng),按常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程限量飼喂。于預產期前7天將試驗母豬轉入徹底消毒過的產仔舍,飼養(yǎng)于全漏縫地板式的單體限位欄內。舍內保持清潔干燥,通風良好,圈舍溫度保持在16～25℃。限制采食,自由飲水。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 繁殖性能

于母豬分娩后,記錄窩產仔數、窩活仔數、窩仔重、窩活仔重、仔豬初生重及活仔初生重等。根據活仔體重判斷IUGR仔豬,判斷標準為:BWx＜BWc-2SD（即體重低于對照組活胎平均體重減去2倍標準差的仔豬為IUGR豬）,并計算IUGR發(fā)生率。

1.5.2 血清NO和TNOS的含量

分別于L-NAME注射前和注射結束時（即妊娠第85天、第105天）采集每頭母豬耳靜脈血液10 m L于采血管,靜置1 h后于3 000 r/m in離心10 min,取上清液置于-20℃保存。測定時,采用NO、TNOS分析試劑盒分別測定血清中NO、TNOS的含量。

1.5.3 胎盤血清NO、TNOS及VEGF的含量

于母豬分娩時,采集每頭母豬胎盤血液10 m L于采血管,靜置1 h后于3 000 r/m in離心10m in,取上清液置于-20℃保存。胎盤血清NO、TNOS含量的測定方法同1.5.2。

于母豬分娩后,從母體面的中央取2 cm×2 cm× 2 cm的胎盤組織塊,置-70℃凍存。測定時,將組織置于冰上進行研磨,超聲粉碎,在4℃下6 000 r/m in離心10 m in,取上清液-20℃保存。測定時,取適量上清液采用VEGF ELISA試劑盒測定胎盤VEGF的含量。

1.6 統(tǒng)計分析

所有試驗數據應用SPSS 16.0軟件進行方差分析,結果以“平均值±標準差”表示,經F檢驗組間差異顯著者再用Duncan氏多重比較,以分析精氨酸對L-NAME刺激后母豬繁殖性能、胎盤血清NO、TNOS及VEGF含量的影響。以P＜0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 精氨酸對L-NAME刺激后妊娠母豬繁殖性能的影響

精氨酸對L-NAME刺激后妊娠母豬繁殖性能的影響見表2。表中數據顯示,從妊娠第85天開始在飼糧中添加1.0%精氨酸（處理Ⅳ）、注射LNAME（處理Ⅱ）或注射L-NAME的同時在飼糧中添加1.0%精氨酸（處理Ⅲ）后母豬的窩產仔數、活仔初生重與正對照組差異均不顯著（P＞0.05）。飼糧中添加1.0%精氨酸后,母豬窩產活仔數由11.20頭提高到12.60頭（P＜0.05）,窩活仔重由16.21 kg提高至18.26 kg（P＜0.05）,而注射LNAME后母豬窩產活仔數降低了19.64%（P＜0.05）,窩活仔重降低了27.14%（P＜0.01）。不過,在注射L-NAME母豬的飼糧中再添加1.0%精氨酸后窩產活仔數、窩活仔重達到正常水平。飼糧中添加1.0%精氨酸后,母豬平均窩產死胎數由1.60頭降低至0.52頭（P＜0.01）,而注射L-NAME后母豬窩產死胎數則顯著提高到3.20頭（P＜0.01）;然而,在注射L-NAM E母豬的飼糧中再添加1.0%精氨酸后達到正常水平。飼糧中添加1.0%精氨酸后,仔豬IUGR發(fā)生率由17.49%降低至6.35% （P＜0.05）,而注射L-NAME后,仔豬IUGR發(fā)生率顯著提高至34.49%（P＜0.01）。但在注射LNAME的同時添加1.0%精氨酸,仔豬發(fā)生IUGR的現象得到有效抑制,即IUGR發(fā)生率與正對照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 精氨酸對L-NAME刺激后妊娠母豬血清NO和TNOS含量的影響

精氨酸對L-NAME刺激后妊娠母豬血清NO和TNOS的影響見表3。由表中數據可知,妊娠第85天,各處理母豬血清NO、TNOS起始含量差異不顯著（P＞0.05）。而在飼糧中添加1.0%精氨酸后,妊娠第105天母豬血清NO含量由338.53 U/m L升高至573.69 U/m L,顯著高于正對照組的377.98 U/m L（P＜0.01）。給妊娠母豬注射LNAME后,妊娠第105天母豬血清NO含量由340.35 U/m L降至113.33 U/m L,顯著低于正對照組（P＜0.01）。補充1.0%精氨酸對注射LNAM E的妊娠母豬血清NO含量沒有影響（P＞0.05）,即NO含量（116.62 U/m L）與負對照（113.33 U/m L）相當。表3還顯示,精氨酸對LNAME刺激后妊娠母豬血清TNOS的影響表現出與NO相似的變化規(guī)律。

2.3 精氨酸對L-NAME刺激后妊娠母豬胎盤血清NO、TNOS及VEGF含量的影響

表4數據顯示,飼糧中添加1.0%精氨酸后母豬胎盤血清NO含量比正對照組高57.9%（P＜0.01）,而給母豬連續(xù)注射21 d的L-NAME后,胎盤血清NO含量比正對照組降低49.7%（P＜ 0.01）。不過,在注射L-NAME的同時給母豬補充1.0%精氨酸后,胎盤血清NO含量達403.51 U/m L,顯著高于負對照組的197.19 U/m L（P＜0.01）,而與正對照組（392.27 U/m L）差異不顯著（P＞0.05）。精氨酸對母豬胎盤血清TNOS的影響表現出與NO相似的變化規(guī)律。

表2 精氨酸對L-NAME刺激后妊娠母豬繁殖性能的影響Table 2 Ef fects o f L-A rg on rep roductive performance o f pregnant gilts induced by L-NAME challenge（n=10）

表3 精氨酸對L-NAME刺激后妊娠母豬血清NO和TNOS含量的影響Table 3 Effects of L-A rg on NO and TNOS contents in serum of pregnant gilts induced by L-NAME challenge （U/m L）

飼糧中添加1.0%精氨酸后母豬胎盤VEGF含量顯著高于正對照組（P＜0.05）,而給母豬注射LNAME后,胎盤VEGF含量為1.85 mg/L,顯著低于正對照組的2.45 m g/L（P＜0.05）。在注射LNAME的同時給母豬補充1.0%精氨酸后,胎盤VEGF含量高于L-NAM E刺激組,但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 精氨酸對L-NAM E刺激后妊娠母豬胎盤血清NO、TNOS及VEGF含量的影響Tab le 4 Ef fects o f L-Arg on NO,TNOS contents in serum and VEGF content of p lacenta o f pregnant gilts induced by L-NAME challenge

3 討 論

對于集約化飼養(yǎng)的豬只來說,引起IUGR的原因多為母豬孕期（尤其是孕中期和孕后期）胎盤運輸能力的低下和功能的缺失[3]。目前,人們對于豬胎兒宮內發(fā)育調控方面的研究還十分有限,IUGR困擾養(yǎng)豬業(yè)的現象也一直在生產上沒有得到很好的解決。直到近來研究人員將精氨酸與母豬胎盤功能聯系在一起后發(fā)現L-精氨酸對妊娠母豬繁殖性能具有明顯的促進作用才獲得了重大突破。Remaekers等[4]研究發(fā)現,在妊娠第14～28天的經產母豬飼糧中添加1.0%的精氨酸,可使窩產仔數增加1頭,而不會影響仔豬平均初生重。M ateo等[2]在妊娠第30～114天的母豬飼糧中添加1.0%的L-精氨酸鹽酸鹽后發(fā)現,平均窩產活仔數從9.13頭增加到11.23頭（比對照組提高了23.0%）,窩活仔重從12.37 kg增加到15.80 kg（比對照組提高了28.0%）。M ateo等[5]在重復試驗中獲得了相似結果。本研究對妊娠85 d的母豬進行的試驗再次印證了上述結論,試驗結果表明,盡管在妊娠后期飼糧中添加1.0%的精氨酸對母豬窩產仔數和活仔初生重沒有顯著影響,但窩產活仔數、窩活仔重得到顯著提高,窩產死胎數和IUGR發(fā)生率明顯降低。

精氨酸是哺乳仔豬的一種必需氨基酸[6]。當母乳作為仔豬唯一的飼糧蛋白質來源時,母乳中精氨酸的含量并不能夠滿足仔豬最佳生長性能的發(fā)揮,因為母乳中精氨酸含量只有1.34 g/L全乳（泌乳第7～21天）,這就意味著母乳每天僅能提供1.06 g的精氨酸,而7日齡仔豬（2.5 kg）日增重為200 g左右,其精氨酸的實際需要量（用于蛋白質沉積及氨基酸代謝）在2.7 g/d以上[7]。但對于性成熟的母豬而言,精氨酸是一種非必需氨基酸。精氨酸之所以在促進母豬繁殖性能方面具有特殊功能,是由于其代謝后的產物發(fā)揮了積極作用。不過,有關精氨酸促進母豬繁殖性能的機理尚無系統(tǒng)的解釋。目前,研究人員普遍將其可歸結為精氨酸代謝后的NO對胎盤血清功能起著調節(jié)作用。由于L-精氨酸在TNOS催化作用下生成具有生物活性的NO,而NO是動物體內細胞信號傳導的重要神經遞質,它可直接激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）,被激活的sGC立即將二磷酸鳥苷（GDP）轉化為環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）,產生的cGMP最終參與到心血管擴張這一核心生理過程中[8]。本研究結果顯示,在飼糧中添加1.0%精氨酸后,母豬血清NO、TNOS含量及胎盤血清NO、VEGF含量均顯著高于正對照組,因此,精氨酸通過NO信號通路,可在一定程度上提高胎盤血流速率,改善胎盤缺氧狀態(tài),進而對胎盤血清養(yǎng)分運輸起著重要的促進作用[9-11]。NO通路不暢將引起妊娠母豬胎盤血清功能的衰退。本試驗結果表明,給妊娠母豬注射L-NAME后,母豬血清和胎盤血清NO、TNOS的合成受到抑制,這是造成該組母豬窩產活仔數、窩活仔重顯著降低,死胎率和IUGR發(fā)生率明顯升高的直接原因。然而,在注射LNAM E母豬的飼糧中補充1.0%精氨酸后,盡管母豬血清NO、TNOS合成量不變,但胎盤血清NO、TNOS合成量明顯升高,窩產活仔數、窩活仔重達到正對照組水平,仔豬發(fā)生IUGR的現象也得到有效緩解。這與Helmbrecht等[12]在大鼠、吳燕等[13]在小鼠中的試驗結果一致。這說明,精氨酸代謝產生的NO彌補了因L-NAME誘導的胎盤血清NO不足,并抵消或逆轉了由L-NAME誘導的胎豬宮內發(fā)育遲緩作用。不過,本試驗中在注射L-NAME母豬的飼糧中補充1.0%精氨酸后,胎盤VEGF合成量并未得到恢復性的提升,這可能是由于連續(xù)給母豬注射L-NAME的持續(xù)時間較長以及飼糧中精氨酸補充的時間較短所致。

4 結 論

①在妊娠后期母豬飼糧中添加1.0%精氨酸后,其窩產仔數、窩仔重不受影響,但窩產活仔數和窩活仔重得到顯著提高。

②妊娠后期母豬飼糧中添加的1.0%精氨酸抵消或逆轉了由L-NAME誘導的胎盤血清TNOS、NO合成減少及胎豬生長受限的作用,促進了胎豬在宮內的生長速率,并有效地預防了IUGR的發(fā)生。

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*Correspond ing au thor,associate professor,E-mail:youjinm@163.com

（編輯 何麗霞）