肖 蘞 ，張增榮 ，黃 毅 ，劉益平 ，朱 慶

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 雅安 625014；2.四川省南充市畜牧局，四川 南充 637100）

本試驗以四川山地烏骨雞為研究對象，利用SYBR GreenⅠ熒光實時定量PCR方法，以雞CAPN 1基因的定量研究為切入點，闡明CAPN 1基因?qū)∪饽鄱鹊淖饔脵C制。通過分析鈣蛋白酶系統(tǒng)與雞肉質(zhì)密切相關(guān)的功能基因（CAPN 1基因）在不同組織的表達差異，探索CAPN 1基因表達的發(fā)育性變化規(guī)律，為進一步研究該基因?qū)?yōu)質(zhì)肉雞嫩度的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和采樣 以四川農(nóng)業(yè)大學培育的山地烏骨雞品種為試驗對象。試驗雞只數(shù)量500只，雞群在相同條件下飼養(yǎng)，分別于 1d、14d、28d、42d、56d、70d和84d每個時間段屠宰6只。屠宰后取胸肌、腿肌、肝臟、心、大腦組織樣品，置于液氮中帶回實驗室，于-70℃冰箱中保存，用于總RNA提取。然后進行熒光實時定量PCR，分析組織CAPN 1 mRNA豐度。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計 參照熒光實時定量PCR SYBR GreenⅠ法引物設(shè)計要求，根據(jù)雞CAPN 1的DNA序列（GenBank 登錄號∶NC_006090.1），雞 Beta-actin基因（內(nèi)參）全序列（Genbank登錄號：NC_006090.1），利用Oligo6.0軟件設(shè)計雞CAPN 1、Beta-actin基因特異引物。CAPN 1引物為 F：5′-GCCAACAGAGAGAAGA TGACAC-3′，R：5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，擴增目的片段長度為116bp，退火溫度57℃；Beta-actin引物為 F∶5′-GCCAACAGAGAGAAGATGACAC-3′；R∶5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，擴增目的片段長度為140bp，退火溫度57℃。

1.3.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 總RNA提取按Trizol Reagent Kit提供的方法進行,并采用紫外分光光度計檢測濃度和純度（OD260/OD280=1.8～2.0）。使用SYBRRPrime ScriptTMRT-PCR Kit中的反轉(zhuǎn)錄反應試劑合成cDNA，反應試劑和條件見試劑盒說明書。

1.3.3 樣品的實時熒光定量PCR檢測

1.3.3.1 構(gòu)建標準曲線 RT-PCR產(chǎn)物用Gel Extraction Mini Kit回收，經(jīng)測序確認后10倍體系稀釋，用于構(gòu)建標準曲線。取1μL稀釋10-3倍再逐級稀釋至10-10倍，以稀釋后的PCR產(chǎn)物作模板，按照定量PCR反應體系進行PCR擴增構(gòu)建標準曲線。每例樣品及陰性對照均設(shè)3個平行復孔，取均值。反應結(jié)束后，由電腦自動得出熒光反應曲線。

1.3.3.2 反應體系及條件 利用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA分別做目的基因（CAPN 1）PCR和內(nèi)參基因（Betaactin）的定量PCR。根據(jù)所設(shè)計合成的目的基因和內(nèi)參基因上游、下游引物給定的Tm值優(yōu)化退火溫度。實時定量 PCR反應體系為 25 μL，其中SYBRRPremix EX TaqTM（2×）12.5 μL、cDNA 2.0μL、上游引物（10μM）0.5μL、下游引物（10μM）0.5 μL、dH2O 9.5 μL。每個樣品設(shè)置3個重復，于實時定量PCR儀上進行PCR擴增。反應程序：95℃ 3min熱啟動HotStar Taq酶活性；94℃ 5s、57℃ 30s，共50個循環(huán)；95℃ 1min、55℃ 1min，55～95℃每 30s升高 0.5℃（共 81個循環(huán)）進行溶解曲線分析，16℃保存。陰性對照以無RNA酶的水代替cDNA模板。反應結(jié)束后，由電腦自動得出熒光反應曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 2003統(tǒng)計各樣品Ct值，參照Kenneth（2001）的方法計算目的基因在樣品與對照品間表達差異的倍數(shù)。

其中，Rel.Quantity表示目的基因在樣品與對照品間表達差異的倍數(shù)；GOI表示目的基因；NORM表示內(nèi)參基因；Eff表示PCR擴增效率。

利用SPSS12.0 For Windows軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，熒光實時定量PCR結(jié)果均用均值±標準差（Means±SD）表示，CAPN 1基因各相對表達量的差異用One-way ANOVA（單因素方差分析）進行分析，并進行Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAPN 1和Beta-actin基因RT-PCR擴增結(jié)果 以山地烏骨雞總RNA為模板，用所設(shè)計的CAPN 1和Beta-actin引物分別進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別獲得116bp和140bp的條帶。兩個基因擴增產(chǎn)物條帶清晰、明亮、無雜帶，說明可以利用這兩對引物進行實時熒光定量PCR。測序結(jié)果與GenBank所提供序列的一致性達100%，為目的基因片段。

2.2 目的基因與內(nèi)參基因的標準曲線和溶解曲線CAPN 1基因標準曲線在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內(nèi)構(gòu)建，對應Ct值為9.34～30.99，標準曲線為：Y=-3.321X+2.658，一致系數(shù) R2=0.988，Eff=100%；Beta-actin基因標準曲線在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內(nèi)構(gòu)建，對應Ct值為6.34～28.34，標準曲線為：Y=-3.564X-4.006，一致系數(shù) R2=0.981，Eff=90.8%。其中，Y為Ct值，X為模板量的對數(shù)值。兩條標準曲線的擴增效率在理想的90%～105%范圍內(nèi)。

2.3 相對定量PCR結(jié)果

2.3.1 山地烏骨雞CAPN 1 mRNA的組織表達差異以各時間點腿肌平均Ct值為對照，計算各組織CAPN 1基因的相對表達量（表1）。結(jié)果表明：除了1d、28d兩個時間點以外，5個組織中的基因表達量均為肌肉（腿肌、胸肌）＞心＞腦＞肝。多重比較結(jié)果顯示：在1d、14d，腿肌顯著高于肝（P＜0.05）；在28d，胸肌極顯著高于其他各組織（P＜0.01），心極顯著高于腦、肝（P＜0.01），腿肌極顯著高于肝（P＜0.01），腿肌顯著高于腦（P＜0.05）；在 42d，胸肌極顯著高于肝、心、腦（P＜0.01），顯著高于腿肌（P＜0.05）；在 56 d，胸肌極顯著高于肝（P＜0.01），顯著高于腦（P＜0.05），腿肌顯著高于肝（P＜0.05）；在70 d，胸肌極顯著高于肝、心、腦（P＜0.01），腿肌顯著高于肝、腦（P＜0.05）；在 84 d，腿肌極顯著高于肝（P＜0.01），顯著高于心、腦（P＜0.05），胸肌顯著高于肝（P＜0.05）。

表1 四川山地烏骨雞5個組織CAPN 1基因的相對表達量 倍

2.3.2 山地烏骨雞CAPN 1 mRNA在不同組織中的發(fā)育性表達 山地烏骨雞的5個組織在各時間點其CAPN 1 mRNA的相對表達量均以84 d樣品平均Ct值為對照（表2）。結(jié)果表明：腿肌中CAPN 1基因的表達量在42d前變化很小，隨后逐漸升高，在52 d達到較高表達量，70d有所回落，最后在84d達到最高點，其中84 d極顯著高于其他各時間點（P＜0.01），56 d顯著高于 1 d、42 d（P＜0.05）；胸肌組織中 CAPN 1 基因的表達規(guī)律和腿肌組織中該基因的表達規(guī)律基本一致，隨著日齡增加而上升并在84 d達到最高點，但在42 d和70d有所回落，其中84d、56d顯著高于1d（P＜0.05）；肝臟組織在1d最低，42d最高，各時間點間差異不顯著（P＞0.05）；心在1d最低，28d最高，各時間點間差異不顯著（P＞0.05）；腦在 42d最低，56 d最高，各時間點間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 四川山地烏骨雞5個組織中CAPN 1基因的發(fā)育性變化 倍

3 討論

本試驗所采集的山地烏骨雞的胸肌、腿肌、心、腦、肝組織樣本中（1～84d），均檢測出CAPN 1基因表達，且表達量較高（Ct值在20.65～30.4之間），這進一步證實了該蛋白酶在雞細胞內(nèi)是普遍存在的，并參與機體的生長與代謝過程。

通過對不同時間點內(nèi)的表達量進行比較分析可以看出，除了1日齡和28日齡，其余各時間點肌肉組織（胸肌和腿?。┚鶠閮?yōu)勢組織，5個組織中的基因表達量均為肌肉（腿肌、胸?。拘模灸X＞肝。Ilian利用核糖核酸酶保護法定量測定CAPN 1基因mRNA在牛和羊各組織中的表達量，得出：骨骼?。拘模靖?。劉安芳等利用半定量RT-PCR的方法，檢測了4個品種雞的10個組織中均有CAPN 1基因mRNA的表達，其中胸?。靖危灸X＞心。不同試驗結(jié)果雖有所差異，但均發(fā)現(xiàn)在肌肉組織中為高表達，證實了該基因可能是影響雞肌肉增長和嫩度的主效基因或與主效基因連鎖。

Morgan等研究認為，CAPN 1是肉嫩化的基本酶類，鈣蛋白酶體系是導致蛋白質(zhì)降解、嫩度提高的關(guān)鍵酶，CAPN 1基因表達量與肌肉嫩度的關(guān)系呈正相關(guān)。大量資料報道表明：肌纖維直徑越小、密度越大，肉質(zhì)就越嫩。在優(yōu)質(zhì)肉雞研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著日齡增加其纖維直徑逐漸變大、密度逐漸降低，尤以56～84d變化明顯。本試驗在研究各組織發(fā)育性表達中，發(fā)現(xiàn)胸肌和腿肌的發(fā)育性模式非常相似：CAPN 1基因表達量在42 d后隨著日齡增加有增長的趨勢。在雞發(fā)育中后期肌肉相對增長減小，單位面積內(nèi)的肌纖維直徑也變小，相應的肌纖維密度增大，而肌肉密度與肌肉嫩度是呈正相關(guān)的，由此得出CAPN 1基因在肌肉組織中的表達量與雞肌肉組織的生長發(fā)育呈相似的變化規(guī)律。

5 結(jié)論

本試驗采用實時定量方法首次測定了CAPN 1基因在山地烏骨雞5個組織中的相對表達量，獲得了該基因在各組織中的表達規(guī)律，結(jié)果表明：CAPN 1基因在各階段均有表達，且表達具有組織差異性，肌肉組織為優(yōu)勢組織；CAPN 1基因在肌肉組織中的表達量與雞肌肉組織的生長發(fā)育呈相似的變化規(guī)律。

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