丁 怡 張明昌

1廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院眼科,武漢 430070

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院眼科,武漢 430022

角膜是眼主要的屈光介質(zhì),正常角膜沒有血管,以保持其透明性。角膜緣則具有豐富的血管網(wǎng),在感染、外傷、免疫反應等病理情況下,毛細血管由角膜緣處向角膜內(nèi)生長。一般認為,毛細血管進入角膜周邊部1～2 mm以上即稱為角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)。雖然新生血管對感染清除,傷口愈合,抑制角膜溶解等有一定作用[1],但CNV可破壞角膜正常微環(huán)境,使眼前節(jié)相關免疫赦免偏離消失[2],是角膜移植排斥反應的高危因素;而且新生血管結構較脆弱,易滲透,常因出血滲出及繼發(fā)纖維化等導致失明,是目前常見的致盲原因之一。角膜新生血管的治療一直是個棘手的問題,對其發(fā)生機制的研究是解決問題的關鍵。

CD105是一種內(nèi)皮細胞增殖的標志物,是轉化生長因子-β(TGF-β)受體復合物的成分之一[3-4]。本實驗通過對CD105在角膜新生血管中的表達來研究其在CNV發(fā)生中的作用,從而希望能指導CNV的治療。

1 材料與方法

1.1 材料

一抗:兔抗大鼠CD105單克隆抗體,兔抗大鼠VEGF單克隆抗體EnVisionTM加強型試劑盒(通用型,含色源底物溶液DAB)(美國 DAKO公司)。1%丁卡因滴眼液,10%水合氯醛,1%阿托品眼膏(均由武漢市協(xié)和醫(yī)院分裝)。美多麗滴(復方托吡卡胺)眼液(日本參天制藥株式會社),鼠堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(美國BioSource公司),瓊脂糖(Spain公司)。Sprague-Dawleg(SD)大鼠(華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部清潔級動物)。

1.2 實驗動物分組

36只SD大鼠,雌雄不限,體重 150～200 g,裂隙燈顯微鏡下檢查無眼前節(jié)疾病,分為正常對照組和實驗組,正常對照組6只。根據(jù)模型制作時間4、7、10、14、21 d將實驗組隨機分為5組,每組6只。

1.3 動物模型制備

方法參見文獻[5-6]。

1.3.1 緩釋藥丸制備 在解剖顯微鏡下用無菌顯微剪將醫(yī)用明膠海綿片剪成1 mm ×1mm ×1 mm的小片,浸入4℃PBS過夜后,用無菌濾紙將水分吸干 。滴加1 μ L(100 ng/μ L,溶劑PBS)bFGF 于明膠海綿小片上,待完全吸收后置于超凈臺內(nèi)干燥48 h形成小藥丸。將此小丸浸入2%瓊脂糖溶液包裹后取出,再置于超凈臺內(nèi)干燥48 h備用。

1.3.2 動物模型制作 術前高壓消毒所有手術器械,所有步驟均在無菌條件下進行。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(30 mg/kg),1%丁卡因雙眼角膜表面麻醉。角膜中央做長約1.5 mm半厚切口,并從此切口用15°角膜穿刺刀向9:00方向角膜緣做潛行隧道,隧道頂端距角膜緣1 mm。用顯微鑷將緩釋藥丸植入隧道頂端。術畢涂四環(huán)素眼膏和阿托品眼膏,觀察期間氯霉素眼藥水點眼,3次/d。

1.4 標本處理

大鼠分別于手術后 4、7、10、14、21 d 后頸椎脫臼法處死,迅速摘除完整角膜組織,用多聚甲醛固定24～48 h,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,2 μ m連續(xù)切片,行免疫組織化學染色。

1.5 形態(tài)學觀察

手術后每日用顯微鏡觀察大鼠角膜、結膜及前房情況。待新生血管長出后,測量其從角膜緣長出的長度和數(shù)量。測量時,以連續(xù)彎曲度小,CNV朝向角膜中心生長的最長血管為準,并計算CNV生長面積A,A=C/12 ×3.1416[r2-(r-I)2],其中C為CNV累及角膜的圓周鐘點數(shù),I為CNV從角膜緣伸入角膜的長度,r為角膜半徑。

1.6 免疫組織化學分析

將連續(xù)切片置于65℃烤箱中放置2～3 h,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,高溫高壓抗原修復。置新鮮配置的3%雙氧水甲醇中室溫下孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物。雙蒸水沖洗3次,每次5 min。滴加1∶100稀釋的一抗,37℃孵育60 min?；謴褪覝睾?蒸餾水漂洗2次,每次1 min;PBS漂洗2次,每次2 min。滴加二抗37℃孵育30 min后漂洗。滴加DAB溶液顯色,顯微鏡下觀察2～10 min控制顯色,蒸餾水沖洗以終止染色。蘇木精復染,脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封片。首先在低倍鏡(10×)視野下掃描整個組織切片,找到染色清晰,背景良好的區(qū)域,然后在高倍鏡(20×)視野下隨機選擇視野,使用HPIAS-2000型彩色圖文分析系統(tǒng)免疫組化分析程序分別對CD105、VEGF染色進行積分吸光度分析,每張切片隨機選取3個視野進行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 12.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理,所有計量資料以±s表示,組間差異比較采用 t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2種因子的表達與CNV增長的相關性采用Pearson相關分析法。

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察

手術后1 d,結膜輕度睫狀充血,局部角膜水腫,囊袋形成良好,藥丸可見,尚無新生血管生長;術后4 d,可見局部角膜輕度水腫,囊袋形成好,藥丸在位,可見少量稀疏細小的新生血管自角膜緣向角膜中心區(qū)長出,血管定向成束向植入物生長,血管范圍局限且管腔較細(圖1A)。此后角膜新生血管逐漸進展,吻合,濃密,呈束狀生長,伸向角膜中心,包裹藥丸。7～10 d達高峰,血管最為密集,管腔最為粗大,充血明顯,完全包裹植入物(圖1B)。2周左右新生血管仍較多較粗,但趨于消退(圖1C)。21 d后趨于平靜,血管開始漸少而細,管腔萎縮,管腔中無血細胞(圖1D)。不同時間CNV面積計算結果見表1。

2.2 免疫組織化學分析

CD105和VEGF陽性表達呈棕黃色或棕褐色染色,定位于微血管內(nèi)皮細胞的細胞膜和(或)細胞質(zhì),各組染色吸光度值檢測結果見表1。

在正常角膜組織中,CD105和VEGF不表達或僅在上皮層呈弱表達(圖2A、2D)。4 d時,角膜新生血管形成,可見CD105和VEGF均表達于血管內(nèi)皮細胞,呈棕黃色染色(圖2B、2E);10 d,角膜新生血管達高峰,CD105和VEGF強表達于血管內(nèi)皮細胞,可成深棕黃或棕褐色染色(圖2C、2F)。各組2種因子的表達與正常對照組比較,其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。2種因子的表達與CNV的增長呈正相關(CD105與CNV面積相關系數(shù)r=0.969 1,P＜0.01;VEGF與面積相關系數(shù)r=0.974 6,P＜0.01)。CD105與VEGF的表達也呈正相關(r=0.999 6,P＜0.01)。

圖1 bFGF植入后CNV的生長變化(×25)Fig.1 The change of CNV after the implantation of bFGF(×25)

表1 各組CNV面積和平均吸光度(A)值(±s,n=6)Table 1 The area of CNV and the average of abso rbance(A,±s,n=6)

表1 各組CNV面積和平均吸光度(A)值(±s,n=6)Table 1 The area of CNV and the average of abso rbance(A,±s,n=6)

Groups Area of CNV(mm2)A values of IHC CD105 VEGF Control 0 0.049±0.009 0.052±0.010 4 d 1.58±0.53 0.292±0.031 0.325±0.037 7d 3.02±0.79 0.625±0.045 0.663±0.047 10 d 3.69±0.96 0.938±0.059 0.986±0.064 14 d 3.12±1.12 0.601±0.050 0.652±0.051 21 d 1.12±0.27 0.273±0.029 0.289±0.026

3 討論

本實驗采用較為成熟的穩(wěn)定有效的角膜囊袋法制作角膜新生血管模型。bFGF能夠在極低濃度(1 ng/mL,約等于1 ng/g)時起作用[7],在機體的胚胎發(fā)育、血管形成、創(chuàng)傷愈合及神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育過程中都起著十分重要的作用[8]。在一系列體外實驗中,它被證實具有對血管內(nèi)皮細胞分化、增生、遷移和趨化作用[9]。bFGF與其靶細胞表面的受體結合之后,可以刺激靶細胞內(nèi)的 DNA合成增加,進而導致細胞的分裂增生[10]。它具有重要的生理功能,可促使微血管的生長分化,使局部的毛細血管數(shù)目增加。實驗證明它誘導的新生血管穩(wěn)定便于研究[11],作為新生血管的直接刺激因子,它能排除炎癥等間接新生血管刺激因素。本實驗通過多次探索,摸索出較為合適的試驗劑量濃度,并達到最好的效果。

圖2 CD105和VEGF在角膜組織中的表達(DAB顯色,×200)Fig.2 The expression of CD105 and VEGF in cornea(DAB,×200)

CD105是一種180 kD的跨膜糖蛋白[12],能特異性結合 TGF-β,是 TGF-β受體復合物的輔助成分之一,其對TGF-β的調(diào)節(jié)作用主要是抑制 TGF-β的生物學效應,主要表現(xiàn)為阻斷對內(nèi)皮細胞生長的抑制以及纖溶酶原激活物抑制劑-1和纖維結合素的合成等[13]。CD105具有特殊的組織學標記,在內(nèi)皮細胞顯著表達,并能選擇內(nèi)皮細胞[14],在人類微血管內(nèi)皮細胞和增生的血管內(nèi)皮細胞中,CD105已被檢測出[15]。它大量表達于細小的和尚未成熟的血管中[16],尤其在再生組織、炎癥組織和腫瘤組織中[17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)敲除CD105基因的裸鼠血管發(fā)育障礙,于妊娠10～11 d死于脈管發(fā)育不全,表明了CD105在血管生成中是必需的。在不同組織和正常組織的血管內(nèi)皮細胞的比較中觀察到CD105能強有力地調(diào)節(jié)其血管內(nèi)皮細胞的生長[19]。

VEGF是1983年被發(fā)現(xiàn)表達于血管內(nèi)皮并命名的細胞因子[20],在1989年被Leung等[21]證明有促進內(nèi)皮細胞有絲分裂的作用。VEGF是刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和移行的重要因子,并可影響血管通透性。本研究發(fā)現(xiàn)VEGF也能在正常大鼠角膜上皮層弱表達,在有新生血管的角膜中可見其在新生血管內(nèi)皮中表達,并且其與CNV的形成呈正相關,這進一步證明了VEGF可以刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖,促進新生血管的形成。CD105同VEGF一樣,也能在正常大鼠角膜上皮層弱表達或無表達,而在有新生血管的角膜中角膜上皮以及血管內(nèi)皮中表達明顯,且其表達強弱趨勢與CNV的發(fā)展一致,在CNV發(fā)展高峰,CD105的表達也最強。我們還發(fā)現(xiàn)CD105與VEGF的表達是一致的。當VEGF呈強表達時,CD105也是較強表達。這說明CD105很有可能與VEGF一樣,同樣在CNV的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。這為我們臨床治療CNV類疾病提供了新的思路,為以CD105為靶向治療CNV的方法提供了理論依據(jù)。

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