龐超見，佟曉杰，劉貴波，李奇，賈樺，王瑩，高海

（中國醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院解剖學教研室，沈陽 110001）

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一類多功能的生長因子，通過與特異性的受體結合可促進內(nèi)皮細胞增殖、誘導血管形成，對調(diào)節(jié)生理性與病理性血管生長起著重要的作用，因而被應用于缺血性血管疾病的治療。隨著組織工程學的不斷發(fā)展，應用支架材料和種子細胞來修復周圍神經(jīng)損傷已經(jīng)日趨成熟。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，BMSC）作為成體干細胞的一種具有多向分化、增殖迅速、長期存活和低免疫原性的特點，可用于神經(jīng)損傷時組織工程化的種子細胞［1］。目前有許多可降解的人工材料已經(jīng)應用到研究當中，例如聚乳酸、殼聚糖和聚羥基乙酸等，但是同種異體脫細胞神經(jīng)細胞外基質(zhì)材料（acellular extracellular matrix，AECM）作為有仿生性的神經(jīng)替代物，更具有良好的仿生性、組織相容性和低免疫原性，移植后為軸突再生提供適宜的微環(huán)境，能夠有效促進神經(jīng)再生［2，3］。本研究利用組織工程學的方法修復神經(jīng)損傷，觀察種植BMSC的脫細胞支架修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損過程中VEGF、S-100蛋白表達及超短波（ultrashortwave，USW）治療對VEGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

Wistar成年大鼠60只，體質(zhì)量為200～250 g，雌雄不限。均由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。Triton X-100（Sigma公司）、脫氧膽酸鈉（華美生物工程公司）、胰酶（Sigma公司）、抗 S-100抗體（Sigma公司）、抗VEGF抗體（美國Santa Cruze公司）、FITC（美國Santa Cruze公司）、TRITC（美國Santa Cruze公司），DAPI（美國Roche公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 化學萃取脫細胞方法制備AECM：無菌條件下，取Wistar大鼠坐骨神經(jīng)，長度為15 mm，去除神經(jīng)外膜用1號縫合線結扎神經(jīng)段兩端，在無菌蒸餾水低滲浸浴12 h；在4%Triton X-100中消化12 h；在無菌蒸餾水中漂洗3 h；在3%脫氧膽酸鈉中持續(xù)振蕩消化12 h，振蕩速率120次/min；重復上述步驟4個周期。萃取神經(jīng)段在4℃的無菌磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BMSC的分離和培養(yǎng)：取Wistar雄性大鼠（20~30 d）3只，10%水合氯醛（0.3 ml/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉和無菌操作下，取出雙側的股骨和脛骨用0.01 mol/L PBS清洗后剪下干骺端兩端，用裝有含10%小牛血清達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM） 的 5 ml注射器從一側穿入股骨髓腔內(nèi)，沖出細胞懸液到50 ml的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，瓶置入37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。48 h后換培養(yǎng)液，加新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)細胞的形態(tài)和密度（占瓶壁面積60%～80%時）進行傳代。

1.2.3 神經(jīng)移植：取傳至第3代BMSC，按1×106/ml的接種密度從經(jīng)消毒處理的脫細胞支架的一端注射，然后置于培養(yǎng)皿，按上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)72 h備用。實驗鼠分為3組，即DMEM組、支架內(nèi)注射BMSC組和支架內(nèi)注射BMSC后應用超短波治療組（USW組）。大鼠用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，手術顯微鏡下暴露坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣5 mm處切除10 mm坐骨神經(jīng)，分別將支架與兩斷端神經(jīng)外膜縫合，USW組在術后應用超短波治療，術后第2，4，8和12周分別取出移植部分。

1.2.4 超短波治療：術后24 h，USW組開始實行超短波治療。超短波治療儀頻率為14.24 MHz，輸出功率為14.24 W，一對4 cm2的圓形電極放置在縫合處皮膚的兩側，距離皮膚1 cm，每日1次，每次7 min，在術后第2，4，8和12周分別取出移植的支架。

1.2.5 半薄切片甲苯胺藍法染色：光鏡觀察有髓神經(jīng)纖維數(shù)和軸突直徑。

1.2.6 免疫熒光染色檢測和積分光密度分析：按照不同的時間點在各組中隨機選出2只大鼠并取材，用4%的多聚甲醛固定過夜，第2日用PBS沖洗3遍后置入30%的蔗糖溶液過夜，然后用OCT包埋作冷凍切片厚度為8μm，放置到用多聚賴氨酸包被的載玻片上。冷丙酮固定10 min，PBS洗5 min，0.5%Triton穿孔15 min，PBS漂洗2次，每次5 min，1%BSA封閉30 min，一抗為抗S-100抗體（1∶150稀釋）和抗-VEGF抗體（1∶100稀釋）混合液，或者是抗S-100抗體（1∶150稀釋）和抗-GFAP抗體（1∶100稀釋）孵育，4℃過夜；第2日PBS洗5 min，加二抗FITC（1∶200稀釋）和 TRITC（1∶200稀釋）混合液孵育 40 min，PBS洗 5 min，5μg/ml DAPI染色2 min，封片，熒光顯微鏡鏡下觀察。以計算機圖像分析儀MPIAS-500檢測積分吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有的數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理和分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，各組間比較采用t檢驗及Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 BMSC的評價

原代培養(yǎng)到3 d時，少許梭形BMSC貼附到瓶壁，另有一定數(shù)量紅細胞懸浮瓶內(nèi)。6～8 d時，單層貼壁的梭形纖維樣細胞明顯增多，并逐漸相互匯合成漩渦樣生長，2周左右，單層貼壁的梭形纖維樣細胞幾乎布滿瓶壁，細胞間隙減少。見圖1。

2.2 再生神經(jīng)纖維的組織學觀察

甲苯胺藍染色，顯示單位面積內(nèi)髓鞘化的神經(jīng)纖維和神經(jīng)束膜的數(shù)目隨時間的增加而增多，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），USW組的神經(jīng)纖維數(shù)目最多。見圖2。

2.3 VEGF、S-100蛋白表達

脫細胞神經(jīng)支架構成的神經(jīng)再生室為注入的BMSC的分化提供了很好的微環(huán)境。免疫熒光雙標方法顯示，術后不同時間點移植神經(jīng)內(nèi)部的施萬細胞標志物S-100和VEGF在各組均為陽性，但在不同的時間點陽性程度或表達數(shù)量不同，在各組第4周時陽性程度最強（圖3）。統(tǒng)計結果顯示移植后12周再生神經(jīng)的S-100和VEGF積分光密度值在USW組高于其他兩組，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 移植后12周各組再生神經(jīng)的S-100和VEGF的積分光密度值比較（x±s）Tab.1 The integrate optical density（IOD）of S-100 and VEGF in regenerated nerves in the three experimental groups at 12 weeks after surgery（x±s）

3 討論

隨著組織工程學的發(fā)展，可降解材料和種子細胞的結合為周圍神經(jīng)損傷的修復帶來了新的解決途徑。脫細胞支架擁有正常神經(jīng)組織完整的基質(zhì)和三維立體結構，提供了有利于再生的組織相容性好、通透性與空隙通道，可促進神經(jīng)再生［4，5］。

施萬細胞對于軸突再生是必不可少的，在周圍神經(jīng)損傷的修復過程中起核心的作用。在移植施萬細胞到脫細胞支架內(nèi)以促進神經(jīng)再生的實驗中，可以呈現(xiàn)施萬細胞在促進修復中的意義［6］。但是由于施萬細胞在體外分離、培養(yǎng)和擴增問題及其在體內(nèi)異源免疫排斥反應等問題，使其在臨床上的應用受到限制［7，8］。BMSC比較容易從供體中獲得且有較大的可塑性，有多潛能分化能力，可在體外和體內(nèi)被誘導成脂肪、成骨、骨骼肌、心肌、內(nèi)皮和神經(jīng)外胚層等多種細胞。BMSC可被誘導分化為施萬細胞樣細胞，以促進神經(jīng)纖維的生長和神經(jīng)髓鞘的形成［9］。

VEGF在正常成熟神經(jīng)組織中不表達或少表達，而在許多病理情況下，如缺血、缺氧、外傷、神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘及代謝等，神經(jīng)組織VEGF及其受體表達顯著增高，這種反應性的增高對受損的神經(jīng)組織起著神經(jīng)保護與營養(yǎng)作用［10］。Hobson 等［11］用硅膠管將坐骨神經(jīng)斷端連接，制成長度為1 cm的再生室模型，局部注入VEGF，發(fā)現(xiàn)10～30 d期間，施萬細胞明顯增殖與遷移，軸突再生也較顯著，且這種作用呈劑量依賴性。VEGF在神經(jīng)再生的過程中起到以下的作用：VEGF刺激神經(jīng)內(nèi)血管與神經(jīng)滋養(yǎng)動脈形成，能為神經(jīng)軸突生長、施萬細胞增生提供所必需的氧分及營養(yǎng)物質(zhì)，保持神經(jīng)微環(huán)境的穩(wěn)定；VEGF通過直接作用于神經(jīng)細胞膜上的受體，促進神經(jīng)軸突生長，即VEGF促進神經(jīng)再生是通過其促血管生長與神經(jīng)營養(yǎng)雙重的結合作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)作為施萬細胞的特征性標志物S-100在各組再生的神經(jīng)中有表達，并呈時間依賴性增多，在12周時達到頂峰，其中USW組在各時間點均表達最高。這說明在再生的神經(jīng)內(nèi)有施萬細胞或施萬細胞樣細胞存在。有研究報道這類細胞來源有兩種：一是由于組織微環(huán)境的存在使移植的BMSC在體內(nèi)被誘導為施萬細胞樣細胞，從而分泌神經(jīng)生長所需的因子促進神經(jīng)再生［12］；二是這些細胞來自于損傷殘端的近側，自身的施萬細胞遷移到支架內(nèi)進而參與神經(jīng)的再生過程。本實驗經(jīng)雙標發(fā)現(xiàn)VEGF與S-100共存于施萬細胞，表明該細胞也能分泌VEGF，而超短波治療可促使其分泌或表達量的增加，從而更好促進神經(jīng)軸突的再生。

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