桂 林 劉云肖 徐德龍 趙淑明

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

“瀉劑結(jié)腸”是由于長(zhǎng)期服用瀉劑而致腸道神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)和相應(yīng)功能紊亂,使結(jié)腸動(dòng)力障礙,對(duì)瀉劑反應(yīng)性降低,從而導(dǎo)致病人對(duì)瀉劑形成依賴(lài)性的一種狀態(tài)。其主要特點(diǎn)是頑固性便秘,其病因、發(fā)病機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)采用大黃浸液建立大鼠“瀉劑結(jié)腸”模型,在不同時(shí)段觀察大鼠胃腸道嗜鉻細(xì)胞及 5-HT的變化,以深入探討“瀉劑結(jié)腸”致慢性傳輸型便秘(STC)的病因及發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 大黃粉購(gòu)自樂(lè)仁堂藥店,大黃粉加 15倍沸水,恒溫浸泡 30min后過(guò)濾制成大黃浸液。

1.2 動(dòng)物 健康成年 Wistar大鼠 72只,雌雄各半,體重(200±20)g,河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證編號(hào):DK 0510071),隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每組 36只,兩組體重、性別無(wú)差異。

1.3 試劑 TP、5-HT標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Sigma公司;總蛋白測(cè)定試劑購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)科技中心;兔抗 5-HT抗血清原液、生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 970型熒光分光光度計(jì),上海精密儀器有限公司;MDF-382E型超低溫保存箱,日本三洋公司;Humalyzer2000型半自動(dòng)生化儀,德國(guó)豪邁公司。

1.5 方法 清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 w后,實(shí)驗(yàn)組用大黃浸液灌胃 1次/d,首日劑量為 800 mg/kg(含生粉),此后每日劑量增加 200 mg/kg,直至實(shí)驗(yàn)組半數(shù)大鼠糞便變稀,保持劑量至80%大鼠稀便消失,繼續(xù)加量給藥,至半數(shù)大鼠糞便變稀,如此程序循環(huán) 3次;對(duì)照組以等體積蒸餾水灌胃。待實(shí)驗(yàn)組第 3次80%的稀便消失 1 w后,大鼠禁食 24 h,經(jīng)口灌入 100 g/L活性炭懸液 2 ml,從活性炭灌胃完畢開(kāi)始計(jì)時(shí),記錄從灌胃到首粒黑便排出的時(shí)間,證實(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠首粒黑便排出時(shí)間顯著延長(zhǎng),腸道傳輸速度明顯減慢,停止給藥。建立模型時(shí)間 77 d,首次出現(xiàn)半數(shù)致瀉大黃粉用量 1 600 mg/kg,最后一次調(diào)整劑量為4 600 mg/kg。

1.6 取材及檢測(cè)指標(biāo) 建立模型過(guò)程中,分別于第一次半數(shù)大鼠稀便時(shí)、第一次 80%大鼠的稀便消失時(shí)、第二次半數(shù)大鼠稀便時(shí)、第二次 80%大鼠的稀便消失時(shí)、第三次半數(shù)大鼠稀便時(shí),隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠各 4只,乙醚麻醉,經(jīng)腹正中切口,迅速切取胃竇、空腸(距幽門(mén) 15 cm)、回腸(距回盲瓣5 cm)、盲腸、橫結(jié)腸、直腸(距肛緣 2 cm)組織塊約 1 cm,生理鹽水沖洗,多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片檢測(cè)。瀉劑結(jié)腸模型建成后,將所有剩余大鼠乙醚麻醉,股動(dòng)脈取血 3 ml,檢測(cè) 5-HT,開(kāi)腹切取距幽門(mén) 5 cm的十二指腸、距肛緣 5 cm乙狀結(jié)腸組織塊,重約 200 mg,檢測(cè)組織勻漿中 5-HT,同前順序切取胃腸道 6塊組織,多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片檢測(cè)。

1.6.1 免疫組化染色觀察腸嗜鉻細(xì)胞變化 鏡下觀察免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞分布及形態(tài),每張切片高倍鏡(400×)下隨機(jī)選取10個(gè)視野,進(jìn)行免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)平均值。

1.6.2 十二指腸、乙狀結(jié)腸組織勻漿中 5-HT含量測(cè)定 十二指腸、乙狀結(jié)腸組織塊制成 20%勻漿,雙縮脲法測(cè)定組織勻漿中的總蛋白(TP)。計(jì)算總蛋白含量 =測(cè)定×標(biāo)準(zhǔn)濃度/標(biāo)準(zhǔn)(g/L)。取組織勻漿 200μl,采用熒光分光光度法測(cè)定組織勻漿中 5-HT熒光強(qiáng)度,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 300μg/L,組織勻漿 5-HT含量 =測(cè)定 ×標(biāo)準(zhǔn)濃度/(標(biāo)準(zhǔn) ×組織 TP含量)(μg/g)。

1.6.3 血清 5-HT含量測(cè)定 同上法,血清 5-HT含量 =測(cè)定 ×標(biāo)準(zhǔn)濃度 /標(biāo)準(zhǔn)(μg/L)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用 x±s表示,采用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行成組 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血清、組織勻漿中 5-HT含量 實(shí)驗(yàn)組大鼠十二指腸、乙狀結(jié)腸組織勻漿中 5-HT含量均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);十二指腸組織勻漿 5-HT含量明顯高于乙狀結(jié)腸。兩組大鼠血清中 5-HT含量比較,無(wú)顯著性差異(P＞0.05);見(jiàn)表 1。

2.2 腸嗜鉻細(xì)胞改變 兩組大鼠胃腸道各段切片的黏膜層均可見(jiàn) 5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性的腸嗜鉻細(xì)胞,分布呈現(xiàn)胃竇密度最高,盲腸密度最低。第一次半數(shù)稀便時(shí),實(shí)驗(yàn)組大鼠胃腸道各段腸嗜鉻細(xì)胞密度明顯低于對(duì)照組(P＜0.01或 P＜0.05),且胞質(zhì)淺染,顆粒減少;在稀便消失時(shí),實(shí)驗(yàn)組大鼠胃腸道各段腸嗜鉻細(xì)胞密度增高,接近對(duì)照組(P＞0.05),并且染色加深,顆粒增多。第二次半數(shù)稀便、稀便消失及第三次半數(shù)稀便的切片中,仍可見(jiàn)上述變化,模型建立,腸傳輸速度明顯減慢,實(shí)驗(yàn)組大鼠胃腸道各段腸嗜鉻細(xì)胞密度高于對(duì)照組(胃竇、空腸、盲腸P＜0.01,回腸 P＜0.05)。見(jiàn)表 2。

表1 兩組血清、組織勻漿中 5-HT含量的比較(x±s,n=36)

表2 兩組大鼠各段腸道黏膜嗜鉻細(xì)胞表達(dá)比較 (x±s,n=36)

3 討 論

STC是因結(jié)腸傳輸功能減弱,致使腸內(nèi)容物滯留而引起的頑固性便秘,部分患者可能是濫用瀉劑所致。臨床上難以取得足夠的腸道全層標(biāo)本,探討其病因、病機(jī)。張連陽(yáng)等〔1〕應(yīng)用大黃,成功建立大鼠瀉劑結(jié)腸模型,為我們研究瀉劑對(duì)腸道的影響提供了有利工具。大黃性寒味苦,含有大黃酚、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等蒽醌衍生物,其致瀉效力與結(jié)合型蒽醌甙含量成正比,游離蒽醌衍生物無(wú)瀉下作用。本實(shí)驗(yàn)參照有關(guān)文獻(xiàn)〔2〕,對(duì)大黃粉采用溫浸法處理,最大限度保留大黃粉的瀉下作用,結(jié)果證明,瀉劑結(jié)腸模型建立成功。

胃腸道黏膜無(wú)神經(jīng)纖維分布,腸嗜鉻細(xì)胞合成并儲(chǔ)存機(jī)體的大部分 5-HT,其頂部突向腸腔,暴露于腸內(nèi)容物中,有微絨毛增加表面積,起機(jī)械、化學(xué)換能器作用,受到刺激后,腸嗜鉻細(xì)胞去極化,導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流〔3〕,通過(guò)胞吐作用將 5-HT釋放入腺腔和黏膜固有層。5-HT通過(guò)與相關(guān)受體結(jié)合,調(diào)控胃腸道感覺(jué)、分泌及運(yùn)動(dòng)功能。具體作用方式有以下 3種:①直接作用于黏膜上皮細(xì)胞或平滑肌產(chǎn)生分泌及運(yùn)動(dòng);②作用于內(nèi)源性傳入神經(jīng)(IPANs)及中間神經(jīng)元,產(chǎn)生并調(diào)節(jié)分泌、蠕動(dòng)反射;③作用于外源性傳入神經(jīng)突觸后膜上的 5-HT3受體,將感覺(jué)信號(hào)傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔4,5〕,因此腸嗜鉻細(xì)胞釋放的 5-HT是胃腸道運(yùn)動(dòng)及分泌的始動(dòng)因素。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為瀉劑大黃主要作用部位在大腸。本研究提示瀉劑結(jié)腸的產(chǎn)生并不是由于腸嗜鉻細(xì)胞破壞,數(shù)目減少,5-HT合成不足,而是長(zhǎng)期應(yīng)用大黃等瀉劑,腸嗜鉻細(xì)胞出現(xiàn)耐受,5-HT釋放相對(duì)減少,不足以維持胃腸道正常運(yùn)動(dòng)及分泌所致,瀉劑結(jié)腸大鼠十二指腸及乙狀結(jié)腸組織勻漿中的 5-HT含量均高于對(duì)照組,也印證了上述觀點(diǎn)。由于胃腸道腸嗜鉻細(xì)胞主要向腺腔及黏膜固有層釋放 5-HT,較少進(jìn)入血液循環(huán),因此兩組大鼠血清 5-HT含量無(wú)明顯差異。

總之,瀉劑大黃導(dǎo)致STC,原于腸嗜鉻細(xì)胞對(duì)瀉劑刺激逐漸耐受,5-HT釋放相對(duì)減少,引起胃腸道蠕動(dòng)減慢、便秘;其作用影響整個(gè)胃腸道黏膜。

1 張連陽(yáng).一種大鼠“瀉劑結(jié)腸”模型的建立〔J〕.大腸肛門(mén)病外科雜志,1998;3(1):66-8.

2 楊士友,黃世福,田 軍.不同提取方法對(duì)大黃瀉下成分的影響〔J〕.安徽醫(yī)藥,2004;9(2):90-2.

3 Racke K,Schworer H.Characterization of the role of calcium and sodium channels in the stimulus secretion coupling of 5-hydroxytryptamine release from porcine enterochromaffin cells〔J〕.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,1993;347:1-8.

4 Camilleri M,Mayer EA,Drossman DA,et al.Improvement in pain and bowel function in female irritable bowel patients with alosetron,a 5-HT3 receptor antagonist〔J〕.Aliment Pharmacol Ther,1999;13:1149-59.

5 Raybould HE,Glatzle J,Robin C,et al.Expression of 5-HT3 receptors by extrinsic duodenal afferents contribute to intestinal inhibition of gastric emptying〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003;284:367-72.