超聲法提取藏藥唐古特烏頭中多糖的研究

藏藥唐古特烏頭為毛茛科植物唐古特烏頭[Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf]的干燥全草。夏末秋初開花期連根采挖，除去雜質(zhì),陰干。具有清熱解毒、生肌收口、燥濕的功能。主治傳染病引起的發(fā)熱、肝膽熱病、血癥、胃熱、瘍瘡、蛇蝎咬傷以及黃水病[1]。

多糖類物質(zhì)廣泛存在于動物、植物和微生物細(xì)胞壁中，是生命有機體的重要組成部分，是除核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類重要的生物分子。研究表明多糖類物質(zhì)具有多種生物活性，如抗腫瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且對機體幾乎無毒副作用[2～5]。

作者在此研究了藏藥唐古特烏頭中多糖的最佳提取條件，用硫酸-苯酚法測定唐古特烏頭中多糖的含量，以期為唐古特烏頭的進一步研究和資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗

1.1 藥材、試劑和儀器

藏藥唐古特烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf(青海亞郎藏藥材公司)，洗凈，干燥,備用。

苯酚、葡萄糖(上海試劑三廠)、無水乙醇、濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純。

譜析T6型紫外可見分光光度計； 上海安亭TDL-40B型離心機； 上海亞榮RE52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；天津泰斯特DK98-1型數(shù)顯恒溫水浴。

1.2 方法

1.2.1 藏藥唐古特烏頭多糖的提取

1.2.1.1 石油醚脫脂

稱取5.0 g 藏藥唐古特烏頭樣品于燒瓶中，加入100 mL 石油醚(沸程60～90℃)，在80℃的水浴中回流提取40 min，冷卻，離心，回收石油醚，重復(fù)2次，將脫脂后的藏藥唐古特烏頭殘渣揮干溶劑，備用。

1.2.1.2 回流提多糖

將脫脂后的藏藥唐古特烏頭粉碎至一定粒度，加入一定量蒸餾水，超聲提取一定時間，冷卻，4000 r· min-1離心5 min，抽濾，收集濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。

1.2.1.3 Sevage法除蛋白

將濃縮的多糖溶液倒入錐形瓶中，加入三氯甲烷-正丁醇(5∶1)混合溶液20 mL，劇烈振蕩20 min，離心，收集上層溶液，重復(fù)操作，至離心后無蛋白質(zhì)沉淀出現(xiàn)、通過紫外光譜檢測無蛋白質(zhì)吸收為止(本實驗重復(fù)7次)。

1.2.1.4 乙醇沉淀多糖

將離心后的上層清液分別轉(zhuǎn)入量筒中,測量體積，按1∶6的體積比加入無水乙醇，得到乙醇含量為80%的一系列多糖混合溶液，靜置過夜，抽濾，濾渣真空干燥，得到藏藥唐古特烏頭多糖產(chǎn)品。

1.2.2 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)藏藥唐古特烏頭中多糖的極性大等特點，以提取液中多糖含量為優(yōu)化指標(biāo)，對提取時間、料液比(質(zhì)量比，下同)和藥材粒度等3個因素進行考察，每個因素取3個水平，根據(jù)L9(34)正交表進行實驗，因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平

1.2.3 多糖含量的測定

1.2.3.1 測定波長的選擇

多糖含量的測定有硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法等，研究表明硫酸-苯酚法的穩(wěn)定性高于硫酸-蒽酮法[6]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，精密吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于50 mL 燒杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振蕩搖勻，然后加入7 mL 濃硫酸并搖勻。顯色35 min。置于比色皿中，在波長400～600 nm之間測定吸收光譜，確定最大吸收波長為486 nm。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，加適量蒸餾水溶解、定容至100 mL，作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL，分別定容至100 mL，再分別取1 mL于50 mL燒杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振蕩搖勻，然后加入7 mL 濃硫酸并搖勻。顯色35 min。在486 nm處測量吸光度值，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)、濃度c(μg· mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：A=0.0054c+0.1417，R=0.9942。

1.2.3.3 藏藥唐古特烏頭提取液中多糖含量的測定

多糖產(chǎn)品用蒸餾水溶解，定容至500 mL，即為待測樣液。吸取1.0 mL樣液于100 mL容量瓶中，按1.2.3.2方法測得其吸光度值，由回歸方程計算藏藥唐古特烏頭提取液中多糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳提取條件的確定

正交實驗結(jié)果與分析見表2。

2.1.1 直觀分析

由表2可知，各因素對藏藥唐古特烏頭中多糖提取的影響大小依次為：A>B>C,即料液比>提取時間>藥材粒度，料液比對提取液中多糖含量的影響較大，藥材粒度相對較小，各因素的最優(yōu)水平組合為A3B2C2，即藥材粒度為8目、料液比為1∶16、超聲提取2 h。

表2 正交實驗結(jié)果與分析

2.1.2 方差分析(表3)

表3 正交實驗方差分析結(jié)果

由表3方差分析數(shù)據(jù)可知，因素A對指標(biāo)有顯著影響，因素C無顯著影響，這與直觀分析結(jié)果基本一致。

2.2 工藝條件的驗證實驗

為了考察最佳提取條件的穩(wěn)定性，按該工藝條件進行3次重復(fù)性實驗，結(jié)果見表4。

表4 工藝驗證實驗結(jié)果/%

由表4可知，藏藥唐古特烏頭提取液中多糖的平均含量為4.03%，RSD為0.16%，均優(yōu)于正交實驗表中的任何一組，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

通過正交實驗，確定超聲法提取藏藥唐古特烏頭中多糖的最佳提取條件為：唐古特烏頭和水的質(zhì)量比1∶16、超聲提取2 h、藥材粒度8目,在此條件下，提取液中多糖含量可達(dá)4.03%。該方法提取得率較高、穩(wěn)定性好，可為藏藥唐古特烏頭藥效的進一步研究和資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2001:307.

[2] 趙宇,黃曉霞.多糖類化合物提取工藝研究[J].甘肅科技縱橫,2006,35(2):223-224.

[3] 孫玉書,畢力夫,蘇秀蘭，等.多糖及多糖類藥物研究概況[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,28(1):75-78.

[4] 石雪萍.植物多糖研究進展[J].糧食與油脂,2005，(8):8-11.

[5] 卓佳,趙浩如.近十年日本植物多糖提取純化技術(shù)的發(fā)明專利[J].藥學(xué)進展,2005,29(6):276-280.

[6] 鐘方曉,任海華,李巖.多糖含量測定方法比較[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(8):1916-1917.