蔡篤雄,陳衛(wèi)昌,曾仕平,湯 凈,林尤冠

(1.海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科,海口570102;2.蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科,蘇州215006)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是臨床上常見的危重疾病,病情進展迅速,早期容易并發(fā)全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),死亡率高。因此,早期干預治療防止急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)由輕型向重癥發(fā)展成為目前重要的研究課題。本實驗通過建立大鼠SAP模型,并給予N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)預處理及氫化可的松治療,以探討NAC及氫化可的松對SAP的治療保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠72只,清潔級,體重200～250g,由蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。?；悄懰徕c(95%)購自Sigma公司,IL-6試劑盒購自Bender Medsystems公司,TNF-α試劑盒購自北京晶美生物工程公司,組織髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所,TNF-α及β-actin引物由上海生工生物工程公司合成,N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)購于上海源聚生物科技公司,氫化可的松琥珀酸鈉注射劑購自天津市生物化學制藥廠。

1.2 實驗分組及動物模型的制備 72只SD大鼠隨機分為4個組。(1)SAP組:18只,參照錢明平等[1]的制模方法以0.1 mL/3min的速度向胰膽管內逆行注入5%?；悄懰徕c(1mL/kg)建立大鼠SAP模型。大鼠SAP的診斷以病理檢查胰腺組織出現(xiàn)腺泡細胞的變性壞死、炎癥細胞浸潤及胰腺周圍出血為標準并參照Schmidt的病理學評分標準。(2)NAC處理組:18只,于模型制作前30min腹腔內注射5%NAC(200mg/kg)進行預處理。(3)氫化可的松治療組:18只,于SAP模型制作成功后10min給予舌下靜脈注射氫化可的松琥珀酸鈉(10mg/kg)。(4)假手術(SO)組:18只,開腹后僅翻動胰腺,即關腹。各組分別于術后3、6h和12h腹主動脈抽血(各組每時點6只),分離血漿保存于-20℃中備測,將大鼠處死,留取胰頭部胰腺組織并分為兩部分,一部分用10%甲醛固定,用于光鏡組織病理學檢查,另一部分快速置液氮中保存,用于提取組織勻漿檢測組織MPO;留取肺組織,右上肺組織用10%甲醛固定,用于光鏡組織病理學檢查,剩余肺組織分3部分置液氮中保存,右下肺組織用于提取組織勻漿檢測組織MPO,左上肺組織用于檢測肺濕/干比值,左下肺組織用于檢測肺組織中TNF-α mRNA的表達。

表1 各組大鼠各時點血漿 AM Y、TNF-α、IL-6水平、胰腺及肺組織MPO的水平、肺濕/干比值、肺組織TNF-α mRNA的表達水平及胰腺組織病理學評分

1.3 觀察指標和檢測方法

1.3.1 血漿淀粉酶采用全自動生化分析儀(Olympus AU-2700)檢測,血漿 TNF-α、IL-6采用ELISA方法檢測,嚴格按試劑盒說明進行操作。

1.3.2 胰腺及肺組織MPO 采用酶化學法測定,以每克組織濕片在37℃的反應體系中 H2O2被分解1μ mol為 1個酶活力單位,MPO(單位/克濕片)=〔測定管吸光度(A)值-對照管A值〕/(11.3×取樣量),該指標反映組織中中性粒細胞的聚集程度。

1.3.3 肺組織濕干比值測定 將左下肺組織從液氮中取出后稱濕重,然后將肺組織置于60℃烘箱內烘烤72h,去除水分,取出稱干重,所得的數(shù)值為肺干重,肺濕/干比值為肺濕重/肺干重,該指標反映肺水腫的程度。

1.3.4 病理學檢查及評分 胰腺及肺組織經(jīng)10%甲醛固定、石臘包埋、HE染色后于光鏡下觀察,并根據(jù)Schmidt等的病理學評分標準對胰腺組織進行評分。

1.3.5 肺組織TNF-αmRNA的表達 采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測,PCR反應條件分別為β-actin:94℃×30s,60℃×30s,72℃×30s;TNF-α:94℃×30s,60℃×30s,72℃×30s共30個循環(huán),結束前72℃×7min以充分延伸。TNF-α引物序列如下:TNF-α(312bp)正義 5′-CTC AAA GAC AAC CAA CTG GTG GTA C-3′,反義 5′-ACA GAG CAA TGA CTC CAA AGT AGA CC-3′,以β-actin(219bp)為內參照,用 TNF-α/β-actin的光密度比值作為肺組織 TNF-α mRNA表達量的測定指標。

2 結 果

2.1 血漿淀粉酶、TNF-α、IL-6水平 SAP組各時間點血漿淀粉酶水平均較SO組顯著升高(P＜0.01),NAC處理組各時間點血漿淀粉酶均較SAP組明顯降低(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計學意義。氫化可的松治療組各時間點血漿淀粉酶水平均較SAP組降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 1。SAP組各時間點血漿 TNF-α、IL-6水平均明顯高于 SO組(TNF-α:3h時 P＜0.05,6、12h時P＜0.01;IL-6:3、6h時 P＜0.05,12h時P＜0.01),NAC處理組各時間點血漿TNF-α水平及3、6h時IL-6水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但12h時IL-6水平與SAP組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。氫化可的松治療組各時間點血漿 TNF-α、IL-6水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 胰腺及肺組織M PO水平 SAP組各時間點胰腺及肺組織MPO水平均明顯高于SO組(胰腺M PO:3h時 P＜0.05,6、12h時P＜0.01,肺組織 MPO:3h時 P＜0.05,6、12h時 P＜0.01),NAC處理組各時間點胰腺及肺組織M PO水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。氫化可的松治療組各時間點胰腺MPO水平與SAP組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),各時間點肺組織M PO水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 肺組織濕/干比值 SAP組 6、12h肺組織濕/干比值均明顯高于SO組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),NAC處理組及氫化可的松治療組6、12h肺組織濕/干比值均明顯低于SAP組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),NAC處理組及氫化可的松治療組各時間點與SO組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.4 肺組織中TNF-αmRNA的表達 SO組肺組織中 TNF-α mRNA呈微弱表達,SAP組各間點肺組織TNF-αmRNA表達水平均較SO組明顯增加(P＜0.01),NAC處理組及氫化可的松治療組各時間點肺組織中TNF-αmRNA的表達水平均較SAP組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(表 1、圖1)。

2.5 胰腺及肺組織病理改變 SO組光鏡下胰腺組織基本正常,SAP組可見胰腺腺泡水腫及腺泡結構消失,葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔顯著增寬,大量炎癥細胞浸潤,腺泡細胞呈不同程度變性壞死,胰腺周圍出血,隨著時間的延長,病變呈進行性加重。NAC處理組各時間點胰腺水腫、出血及炎癥細胞浸潤均較SAP組減輕,少數(shù)偶見局灶性腺泡細胞變性壞死,氫化可的松治療組胰腺水腫、出血、壞死及炎性細胞浸潤仍較明顯,各時間點與SAP組比較未見明顯減輕。病理學評分:SAP組各時間點胰腺組織病理學評分均顯著高于SO組(P＜0.01),NAC處理組6、12h胰腺組織病理學評分均明顯低于SAP組(P＜0.05),氫化可的松治療組各時間點胰腺組織病理學評分與SAP組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(表1)。SO組光鏡下肺組織無明顯變化,SAP組可見肺泡壁水腫,肺間質及肺泡腔有大量中性粒細胞及單核細胞浸潤,肺泡結構紊亂,肺內可見散在出血灶,肺血管內可見血栓形成,且隨著時間的延長,病變逐漸加重。NAC處理組及氫化可的松治療組各時間點肺泡壁、肺間質水腫均較SAP組減輕,炎癥細胞浸潤明顯減少,肺泡結構基本正常,肺內未見出血灶。

圖1 4個組大鼠各時點肺組織TNF-α mRNA的表達電泳圖

圖2 各組6h時胰腺組織的病理改變(HE×100)

圖3 各組12h時肺臟組織的病理改變(HE×100)

3 討 論

重癥急性胰腺炎(SAP)的發(fā)病機制尚未完全闡明,研究表明,重癥急性胰腺炎由于眾多炎癥介質和細胞因子的瀑布樣級聯(lián)反應,從而導致 SIRS和并發(fā)急性肺損傷,其中 TNF-α、IL-6在SAP的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[2],早期對SAP發(fā)病過程中的 TNF-α、IL-6進行干預對SAP具有重要的治療保護作用[3]。

TNF-α、IL-6等細胞因子的轉錄、合成受核因子-κ B(NF-κ B)的調控,在SAP時大量的氧自由基激活 NF-κ B,并進一步激活IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子的轉錄、合成,促進細胞因子的大量生成,從而導致SIRS和 MODS。Hyeyoung等[4]研究發(fā)現(xiàn),運用抗氧化劑NAC能抑制大鼠AP時胰腺組織NF-κ B的激活,使胰腺細胞內上述細胞因子表達顯著降低,從而改善AP的病情。另外,動物研究表明,給予氫化可的松預處理或治療后能顯著降低SAP時 TNF-α、IL-6水平,明顯提高動物生存率[5]。本實驗中,SAP組血漿 TNF-α、IL-6水平顯著升高,給予 NAC預處理及氫化可的松治療能顯著降低血漿TNF-α、IL-6水平,結果表明,NAC及氫化可的松可通過減少TNF-α、IL-6的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎癥效應,改善SAP的病情。

研究發(fā)現(xiàn),SAP時肺組織中TNF-αmRNA呈現(xiàn)強烈與持久的表達,TNF-αmRNA的表達水平與肺損害程度呈正相關[6]。本實驗中,SAP組肺組織TNF-αmRNA的表達顯著增加,NAC處理組及氫化可的松治療組肺組織TNF-αmRNA表達水平均較SAP組顯著降低,肺組織病理損傷較SAP組明顯減輕,表明給予NAC預處理及氫化可的松治療對SAP肺損傷可能具有重要的治療保護作用。

本實驗中,給予NAC預處理能顯著降低SAP時胰腺及肺組織MPO水平,明顯降低肺濕/干比值,并能明顯減輕胰腺及肺組織的病理損傷,表明給予NAC預處理能明顯減輕胰腺及肺組織中中性粒細胞的浸潤,減輕胰腺及肺組織的炎癥反應,改善SAP時胰腺及肺組織損傷。另外,給予氫化可的松治療能顯著降低SAP肺組織中M PO的水平及肺組織濕/干比值,并能明顯減輕各時間點肺組織的病理損傷,提示給予氫化可的松治療能明顯減輕肺組織炎癥反應及肺水腫,改善肺組織損傷。但在本實驗中,氫化可的松治療組血漿淀粉酶水平、胰腺組織MPO水平、胰腺組織病理學評分與SAP組比較均無明顯差異,胰腺組織病理損傷與SAP組相比未見明顯減輕,說明氫化可的松治療并不能改善SAP時胰腺組織的病理損傷。

綜上所述,NAC及氫化可的松可通過減少細胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,改善 SAP的病情,早期應用抗氧化劑及激素進行干預對重癥急性胰腺炎具有一定的治療保護作用。

[1]錢明平,房林,沈蓉蓉,等.BD針在大鼠急性胰腺炎模型中的應用[J].重慶醫(yī)學,2008,37(11):1219.

[2]陸海華,史忠,劉波,等.急性胰腺炎相關性肺損傷患者早期血清 TNF-α、IL-1、IL-6的變化及其臨床意義[J].重慶醫(yī)學,2007,36(18):1818.

[3]Sevillano S,De la Mano AM,Manso M A,et al.N-acetylcysteine prevents intra-acinar oxygen free radical production in pancreatic duct obstruction-induced acute pancreatitis[J].Biochim Biophys Acta,2003,1639:177.

[4]Hyeyoung K,Jeong YS,Kwan HR,et al.Suppression of NF-kB activationg and cytokine prodution by N-Acetylcysteine in pancreatic acinar cells[J].Free Radic Biol Med,2000,29:674.

[5]Osman MO,Jacobsen NO,Kristensen JU,et al.Beneficial effects of hydrocortisone in a model of experimental acute pancreatitis[J].Dig Surg,1999,16(3):214.

[6]張剛,修瑞齡,楊訓,等.腫瘤壞死因子α基因表達、細胞凋亡與急性胰腺炎肺損傷關系的實驗研究[J].中華消化雜志,2002,22(1):22.