關(guān)文怡，曹授俊，齊軍喆

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442）

用激素處理動(dòng)物進(jìn)行超數(shù)排卵是進(jìn)行胚胎移植、轉(zhuǎn)基因、克隆等研究的基礎(chǔ)之一，通過(guò)超數(shù)排卵獲得大量整齊、優(yōu)質(zhì)的卵子或受精卵是胚胎移植的關(guān)鍵技術(shù)之一。近年來(lái)，隨著遺傳工程小鼠的大量開(kāi)發(fā)，人們對(duì)小鼠卵母細(xì)胞和受精卵的需求量日趨增多，因而完善的超數(shù)排卵技術(shù)是遺傳工程小鼠研究獲得成功的重要前提條件。本實(shí)驗(yàn)在雌鼠的年齡與體重、激素的注射時(shí)間等因素不變的條件下，以C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其注射不同劑量的PMSG和HCG進(jìn)行超數(shù)排卵，并分析所獲得的卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5～6周齡C57BL/6雌性小鼠30只，8周齡C57BL/6雄性小鼠，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械 實(shí)體顯微鏡Nikon SM2645，日本Nikon公司生產(chǎn)；手術(shù)器械：剪毛剪、手術(shù)剪、鑷子等；口吸式移卵管。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)超數(shù)排卵激素（PMSG，HCG）均購(gòu)自寧波市激素制品有限公司；其余試劑除特殊說(shuō)明外均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 選用5～6周齡的C57BL/6雌鼠36只（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供），自由采食和飲水，室溫 20±2℃，控光（光照 14h/d，6∶00～20∶00）。經(jīng)過(guò)一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按照注射劑量不同隨機(jī)分為A、B、C三組，A組8只，B組13只，C組15只。A組注射 PMSG 2.5 IU，HCG 2.5 IU；B 組注射 PMSG 5.0 IU，HCG 5.0 IU；C組注射PMSG 7.5 IU，HCG 7.5 IU。每只小鼠腹腔注射PMSG，間隔48h后分別注射HCG進(jìn)行超數(shù)排卵，再與性成熟同系公鼠合籠，次日早上檢查陰道栓，有栓雌鼠就用頸椎脫臼法處死，然后將輸卵管摘除置于盛有M2培養(yǎng)液的表面皿中，在實(shí)體顯微鏡下找到輸卵管膨大部，用1mL注射器沖洗輸卵管，再用移卵管收集卵母細(xì)胞。超數(shù)排卵處理后，對(duì)不同處理組的雌鼠進(jìn)行卵母細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確定不同劑量的激素注射對(duì)C57BL/6小鼠超數(shù)排卵的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS軟件對(duì)C57BL/6小鼠不同劑量組的平均取卵數(shù)采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)分為A、B、C三個(gè)劑量組，各組獲得的卵子數(shù)量如表1所示。C57BL/6小鼠B組的平均取卵數(shù)極顯著地高于A組的平均取卵數(shù)；B組的平均取卵數(shù)顯著地高于C組的平均取卵數(shù)；C組與A組的平均取卵數(shù)差異不顯著。

表1 C57BL/6小鼠超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 分析與討論

在哺乳動(dòng)物發(fā)情周期中給予大劑量外源性FSH或類似物，可誘發(fā)大量卵母細(xì)胞發(fā)育，排卵數(shù)可超過(guò)正常排卵數(shù)的若干倍。在小鼠的超排實(shí)驗(yàn)中，一般用孕馬血清促性腺激素（PMSG）模仿內(nèi)源性促卵泡素（FSH）的促進(jìn)卵成熟作用，人絨毛膜促性腺激素（HCG）模仿促黃體素（LH）的誘導(dǎo)作用。超數(shù)排卵的成功與否取決于以下幾種因素：雌鼠的年齡與體重、激素的劑量、注射時(shí)間以及小鼠的品系。

關(guān)于小鼠超數(shù)排卵的最適合激素劑量，目前國(guó)外多采用PMSG與HCG各5 IU或各7.5 IU劑量，國(guó)內(nèi)有的采用PMSG與HCG各5 IU或各10 IU劑量，也有用PMSG與LH協(xié)同處理超排小鼠的報(bào)道。由此可知，就激素劑量方面的研究結(jié)果也是有一定差異的，這可能與超數(shù)排卵受到多種因素的影響有關(guān)。對(duì)于大多數(shù)品系小鼠，推薦的PMSG劑量是腹腔注射5 IU，但對(duì)有些品系小鼠PMSG劑量?jī)H2.5 IU或多達(dá)10 IU其效果可能更好。李子義等在“不同激素劑量對(duì)幼鼠超數(shù)排卵及超排卵質(zhì)量的影響”中報(bào)道，以PMSG與HCG各10 IU劑量對(duì)5～6周齡小鼠進(jìn)行超排，結(jié)果排卵數(shù)分別是42.2枚和40.2枚。

另一種促性腺激素是HCG，用來(lái)誘發(fā)成熟卵泡破裂，HCG的注射劑量一般為5 IU，但對(duì)某些品系小鼠來(lái)說(shuō)，適合的劑量可能在2.5 IU～10 IU之間。本實(shí)驗(yàn)選用5～6周齡的C57BL/6雌鼠，采用3種不同劑量組合在自由采食和飲水，室溫20±2℃，控光（光照14h/d，6∶00～20∶00）的條件下進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果表明采用PMSG 7.5 IU、HCG 7.5 IU劑量的這組其排卵數(shù)顯著高于其他組，為較好的超數(shù)排卵方案。

小鼠超數(shù)排卵效果除與激素劑量不同有關(guān)外，還可能與實(shí)驗(yàn)小鼠個(gè)體的日齡、發(fā)情周期、體重及營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)。

[1]王建辰.家畜生殖內(nèi)分泌學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社，1991.

[2]KodayashiK，OkuyamaM，F(xiàn)ujimoto G，etal.Subzonal insemination with a single spematozoon using manipulation assisted sperm adhesion onto theooplasmic membrance in mouse ova[J].Mol.Rprod Dev，1992，31：223-229.

[3]Kimura Y，Yanagimachi R.Mouse oocytes injected with test l2 cularspermatozoa or round spermatids can develop into normal off spring[J].Development，1995，121：2397-2405.

[4]李 秦，朱德生，劉玉林，等.不同激素對(duì)哺乳動(dòng)物超數(shù)排卵作用的研究 [J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，1997，14（3）：126.

[5]劉紅林，范必勤，陳宜峰，等.小鼠卵母細(xì)胞的乙醇激活[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，19（4）：56-60.

[6]錢菊汾.PMSG配合LH促使小鼠超數(shù)排卵效果分析[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，15（1）：25-28.

[7]李子義，譚景和，孫興參，等.不同激素劑量對(duì)幼鼠超數(shù)排卵及超排卵質(zhì)量的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1999，（3）：224.