朱登峰 ，唐冬英 ，李明芳 ，劉選明

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 儋州 571737；2.湖南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)研究院，湖南 長(zhǎng)沙410082；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

冷凍切片法、石蠟切片法和徒手切片法是實(shí)驗(yàn)過程中常用的3種制作切片方法。冷凍切片主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)病理診斷[1]，適于開展細(xì)胞免疫化學(xué)和原位雜交等研究。這是因?yàn)樗恍枰獙悠方?jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的脫水包埋，能更好地保證抗原分子的穩(wěn)定性[2]。徒手切片法是直接利用手拿刀片將植物新鮮材料切成薄片，制成切片的一種方法。徒手切片簡(jiǎn)便易行、不需要專門的技術(shù)和儀器設(shè)備，且在切片過程中不需要特殊的化學(xué)試劑處理（如脫水劑及包埋劑），因此在植物材料中廣泛應(yīng)用[3]。而石蠟切片法是用石蠟作為包埋劑的一種顯微制片方法，為顯微制片技術(shù)中最常用的方法之一。如石蠟永久制片、石蠟切片。為了更清楚有效地觀察植物木質(zhì)部結(jié)構(gòu)，本文采用了一種快速冷凍切片法，并與石蠟切片技術(shù)及徒手切片法進(jìn)行比較，旨在探索出一種相對(duì)較好的細(xì)胞學(xué)切片方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍(lán)型油菜（Brassica napusL.）N529及擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）哥倫比亞生態(tài)型col-4為材料，OCT包埋劑，石蠟，二甲苯，F(xiàn)AA固定劑，36%甲醛，冰醋酸，乙醇，蒸餾水，1%的間苯三酚（95%乙醇配制）和25%的鹽酸等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 快速冷凍切片法 快速冷凍切片方法如下：取材→置于樣品托頭上→OCT包埋劑包埋→－30℃快速冷凍固定→切片→貼片→染色觀察。首先啟動(dòng)Leica CM 1800冷凍切片機(jī)降溫開關(guān)，把機(jī)箱溫度降低至-25～-30℃，待溫度穩(wěn)定時(shí)，剪取油菜及擬南芥莖（長(zhǎng)約0.1～0.3 cm）置于樣品托頭上，然后直接用OCT包埋劑進(jìn)行包埋，涂抹均勻，使樣品深埋其中，再置于速凍架上，迅速冷凍并固定在樣品托頭上。包埋劑OCT變白后，把樣品托頭移至切片機(jī)的機(jī)頭上，擰緊機(jī)頭螺絲，搖動(dòng)旋轉(zhuǎn)杠桿進(jìn)行修塊切片。設(shè)置切片厚度（25～100 μm），進(jìn)行切片，在切片上加1～2滴1%間苯三酚和25%鹽酸染色30 min；Nikon倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.2 徒手切片法 徒手切片法如下：取材→徒手切片→濕毛筆將薄片放人盛水培養(yǎng)皿中→挑選透明的薄片→載玻片上染色觀察。

1.2.3 石蠟切片法 石蠟切片法如下[4]：取材→FAA固定液固定24 h→脫水（依次50%、60%、70%、80%、90%、100%、100%乙醇每級(jí)1～2 h）→透明（1/2二甲苯+1/2乙醇、純二甲苯、純二甲苯每級(jí)2 h）→透蠟（2/3二甲苯+1/3石蠟4～8 h或過夜→1/3二甲苯+2/3石蠟2 h、純石蠟2 h、純石蠟2 h）→包埋→切片、貼片→展片→染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種切片的植物莖組織觀察

木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類聚合物，包圍于管胞、導(dǎo)管、木纖維等纖維束細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外，并使這些細(xì)胞具有特定顯色反應(yīng)：加間苯三酚溶液數(shù)滴，待片刻，再加鹽酸數(shù)滴，即顯紅色；在倒置顯微鏡下觀察3種切片結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)過程中可以發(fā)現(xiàn)，快速冷凍切片在處理硬度較大的材料時(shí)，組織細(xì)胞間易破裂（圖1 A），而在處理油菜頂端莖組織和擬南芥嫩莖切片時(shí)，可得到較完整且清晰的切片（圖1 B、C）；石蠟切片和徒手切片結(jié)構(gòu)都很完整（圖1 D、E、F）。木質(zhì)素組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示石蠟切片經(jīng)過各級(jí)脫水處理后，染色對(duì)比度不好，木質(zhì)素染色顏色不深，為淡紅色。徒手切片容易產(chǎn)生視野較暗的切片（圖1 F），主要可能是切片透明度不夠，厚薄不均勻產(chǎn)生。

圖1 油菜和擬南芥主莖橫切面間苯三酚-HCl組織化學(xué)染色圖（100×）

2.2 3種切片方法的比較

3種細(xì)胞學(xué)切片方法的比較如表1所示，從表中可以看出，3種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。徒手切片法方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，但切片質(zhì)量不高，對(duì)材料有要求；石蠟切片法切片質(zhì)量好，但操作繁雜，成本較高；快速冷凍切片法比較簡(jiǎn)便、有效、易操作，能切出較高質(zhì)量的切片。

3 討論

在植物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)上，切片制作的質(zhì)量非常重要，直接影響到教學(xué)和實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。通過應(yīng)用上述3種切片方法鑒定生物組織中的有機(jī)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：3種方法都可以獲得細(xì)胞形態(tài)完整、組織結(jié)構(gòu)清晰、對(duì)比度較好的切片。徒手切片技術(shù)在植物學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較早、且比較普遍。它可以觀察新鮮材料組織和細(xì)胞的天然色彩，直接觀察活體細(xì)胞結(jié)構(gòu)狀態(tài)。通常不經(jīng)染色或經(jīng)簡(jiǎn)單染色后，制成臨時(shí)的水裝片，亦可以通過脫水與染色制成永久制片。徒手切片易產(chǎn)生視野較暗的切片，結(jié)合石蠟切片的透明劑，觀察效果可能會(huì)更好。石蠟切片法為制片技術(shù)的經(jīng)典方法，是植物學(xué)、病理學(xué)和醫(yī)學(xué)等學(xué)科觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的主要方法，也廣泛地用于生物教學(xué)實(shí)驗(yàn)和其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。石蠟切片也與其他新技術(shù)相結(jié)合，如張舍郁[5]將免疫熒光檢測(cè)技術(shù)與石蠟切片相結(jié)合，用于抗原定位。它還用于細(xì)胞原位核酸分子雜交技術(shù)中[6-7]，可對(duì)材料中被雜交的DNA分子進(jìn)行定位、定量分析或觀察分析基因表達(dá)（mRNA）水平。快速冷凍切片多應(yīng)用在細(xì)胞免疫化學(xué)和原位雜交等研究中，主要在于它能很好地保存細(xì)胞內(nèi)生物分子的活性，因此在動(dòng)物和人體的組織研究中得以廣泛應(yīng)用。由于植物細(xì)胞有細(xì)胞壁和大液泡，含水量大，在低溫冷凍過程中容易形成冰晶，硬度變大，材料硬度太大是造成組織切片破碎的主要原因[8]，難以切出結(jié)構(gòu)完整的組織切片；而且細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的冰晶會(huì)損傷細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)，影響其在植物細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞免疫化學(xué)等研究中的應(yīng)用。細(xì)胞嚴(yán)重傷害主要發(fā)生在速凍的降溫及解凍的過程中[9]，因此普遍采用冷凍保護(hù)劑的方法來解決上述植物冷凍切片中存在的問題。陳丹[2]等用蔗糖保護(hù)-液氮速凍法及林月惠[10]用甘油作冷凍保護(hù)劑分別進(jìn)行冷凍切片，從而獲得薄且結(jié)構(gòu)完整的切片；寧代鋒[11]等人采用冷凍切片技術(shù)結(jié)合適當(dāng)回溫的方法也制作出了植物細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)完整的切片。冷凍切片技術(shù)已逐漸在植物組織切片中得到應(yīng)用[12-15]。謝佩松[14]和劉劍鋒[15]等認(rèn)為通過冷凍切片法可在短時(shí)間內(nèi)（1 d）獲得高質(zhì)量切片。在快速冷凍切片過程中切片不宜過薄過厚，切片太?。ㄐ∮?0 μm）易碎、易卷曲；反之，切片太厚（大于50 μm），有皺折及折疊形成?？焖倮鋬銮衅ㄖ谱鞯那衅w結(jié)構(gòu)完整，導(dǎo)管、木纖維細(xì)胞、韌皮纖維細(xì)胞及髓部薄壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。實(shí)驗(yàn)證實(shí)快速冷凍切片法是一種簡(jiǎn)便有效的制作植物組織切片的方法。

表1 3種切片方法的比較

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