霍學(xué)敏,呼天明,楊培志,孫偉澤,韓云華

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100）

紫花苜蓿Medicago sativa是我國(guó)干旱半干旱地區(qū)廣泛種植的一種牧草,具有抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等諸多優(yōu)點(diǎn),是反芻動(dòng)物的理想飼料,在我國(guó)的畜牧業(yè)發(fā)展和改善生態(tài)環(huán)境中起著非常重要的作用[1]。

干旱是造成苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)下降的一個(gè)主要原因[2]。近年來有許多關(guān)于植物抗旱生理方面的研究[3-11],大多采用PEG處理的方法模擬干旱脅迫,但此方法同時(shí)也造成滲透脅迫。本試驗(yàn)首次采用了改良空氣干旱法對(duì)苜蓿進(jìn)行干旱處理,用試劑盒測(cè)定了丙二醛（MDA）含量、抗壞血酸（AsA）含量和過氧化物酶（POD）活性3項(xiàng)生理指標(biāo),以期了解苜?？购档纳頇C(jī)制,為苜?？购涤N提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)選用紫花苜蓿品種金皇后商品種子,浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%濃硫酸中1 h打破休眠,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%次氯酸鈉溶液消毒5 min,最后用蒸餾水沖洗至pH值中性。將處理后的種子擺放在直徑12 cm的培養(yǎng)皿中（100粒/皿）于人工氣候培養(yǎng)箱（ZPQ-350型）內(nèi)20℃恒溫連續(xù)暗培養(yǎng)3 d后再移入營(yíng)養(yǎng)缽（內(nèi)徑9 cm,高9 cm）中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基質(zhì)為河沙,培養(yǎng)液為1/4Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。幼苗培養(yǎng)于2008年12月在西北農(nóng)林科技大學(xué)全自動(dòng)PVC溫室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法待苜蓿長(zhǎng)出3～5片真葉時(shí),用自來水洗出根,得到完整植株。用改良空氣干旱法進(jìn)行干旱處理：即用高級(jí)吸水紙將根部包起后懸于細(xì)鐵絲上進(jìn)行0、1.5、3、4.5和6 h的干旱處理（室內(nèi)溫度15℃,濕度55%～50%）,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別準(zhǔn)確稱取0.5 g地上部分和地下部分新鮮樣品待測(cè),重復(fù)3次。每份樣品加入pH值7.4的磷酸緩沖液4.5 mL,冰浴研磨,8 000 r/min下低溫離心15 min,取上清液測(cè)定其中的MDA含量、AsA含量和POD活性。指標(biāo)測(cè)定均采用南京建成生物公司生產(chǎn)的試劑盒按說明書步驟操作,測(cè)定原理分別為硫代巴比妥酸（TBA）法、啡羅啉法和愈創(chuàng)木酚法。以每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μ g底物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)處理方差分析采用SPSS16.0軟件；繪圖采用Excel2003軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿MDA含量的影響MDA是質(zhì)膜過氧化作用的產(chǎn)物之一,其含量一般用來指示膜脂質(zhì)過氧化的程度[12]。試驗(yàn)中苜蓿地上部分和地下部分的MDA含量均隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)（圖1）。地上部分增加緩慢,6 h后才有顯著變化；地下部分在干旱3 h內(nèi)增加緩慢,3 h后急速增加,增加速率是之前的13倍,說明此時(shí)苜蓿根系已經(jīng)受到一定程度的過氧化傷害,發(fā)生了脂質(zhì)過氧化作用。干旱6 h,苜蓿地下部分的MDA含量達(dá)到最大,為14.54 μ mol/g。在整個(gè)干旱過程中,苜蓿地下部分的MDA含量始終高于地上部分,說明根部比地上部分對(duì)干旱更為敏感。

圖1 干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿MDA含量的影響

2.2 干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿AsA含量的影響AsA在氧化脅迫防御中起重要作用,作為植物體內(nèi)重要的抗氧化劑,它可通過多種機(jī)制來減少活性氧的量,一方面AsA能直接清除超氧陰離子、單線態(tài)氧、羥自由基和過氧化氫等活性氧,另一方面AsA能作為抗壞血酸過氧化物酶清除過氧化氫的電子供體,來間接地清除活性氧[13]。隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng),苜蓿地上部分和地下部分的AsA含量均呈逐漸增加的趨勢(shì)（圖2）。干旱4.5 h,地上部分的AsA含量與對(duì)照相比有了顯著增加；地下部分的AsA含量在3 h前增加緩慢,3 h后增加速率加大,是之前的6.35倍。說明此時(shí)苜蓿已經(jīng)感受到由干旱引起的氧化脅迫,并啟動(dòng)了非酶系統(tǒng)來減輕自身的受害程度。整個(gè)過程中,地下部分的AsA含量始終高于地上部分,AsA含量顯著增加的時(shí)間也短于地上部分,說明根系對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)較地上部分更為靈敏。

圖2 干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿ASA含量的影響

2.3 干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿POD活性的影響POD是植物體內(nèi)一種非常重要的保護(hù)酶,可以清除體內(nèi)的過氧化氫和其他一些活性氧自由基,與其他一些保護(hù)酶（如SOD、CAT等）一起保護(hù)植物免受氧脅迫傷害。苜蓿地下部分的POD活性隨著干旱時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì),地上部分并未發(fā)生明顯變化（圖3）。干旱1.5 h,地下部分的 POD活性與對(duì)照相比下降了7.79%,但方差分析并不顯著。之后一直呈上升趨勢(shì)。3 h后上升速率加快,是之前的9.11倍,說明此時(shí)苜蓿根部已經(jīng)感受到活性氧的脅迫并且啟動(dòng)了保護(hù)酶系統(tǒng)進(jìn)行防御。干旱6 h后,POD活性達(dá)到最大,比對(duì)照增加了81.7%,說明此時(shí)正是POD發(fā)揮其清除自由基作用的黃金時(shí)期。

圖3 干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿POD活性的影響

3 討論與結(jié)論

李文嬈等[14]研究發(fā)現(xiàn)：紫花苜蓿葉片及根系MDA含量在脅迫初期未發(fā)生明顯變化,但隨著脅迫的延續(xù)而逐漸累積,根系MDA含量變化幅度明顯大于葉片,與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。阿爾岡金葉片及根系的POD活性隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng),葉片POD活性在脅迫12 h達(dá)到最大值,并保持較高活性,根系POD活性在脅迫24 h達(dá)到最大值后略有下降,而本試驗(yàn)結(jié)果顯示苜蓿根部POD活性呈逐漸增加的趨勢(shì),地上部分POD活性則無明顯變化。可能是干旱處理程度輕,時(shí)間短所致。王文斌等[15]研究發(fā)現(xiàn)：苜蓿芽中POD活性在氯化鈉脅迫前后無顯著變化,且明顯低于根,認(rèn)為其具有器官差異性,POD在根中比在芽中可能發(fā)揮著更為重要的作用,與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。他們還發(fā)現(xiàn)芽中同工酶譜帶少于根,各同工酶活性也較弱,認(rèn)為由此導(dǎo)致芽中的POD活性明顯低于根。

呂長(zhǎng)平等[16]在對(duì)草莓Fragaria ananassa的研究中發(fā)現(xiàn)：隨水分脅迫程度的加深,抗壞血酸含量不斷降低,且抗旱性強(qiáng)的品種高于抗旱性中等和抗旱性弱的品種,其含量與抗旱性呈正相關(guān)。但也有研究[17]顯示：植物在諸如臭氧、SO2高鹽、低溫和干旱等逆境中,體內(nèi)的AsA含量至少會(huì)暫時(shí)的增加,其原因主要是由于AsA合成酶和再生酶活性的增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明：在短時(shí)間的輕度干旱脅迫下,隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng),紫花苜蓿地上部分和地下部分的AsA含量均逐漸增加,可能也與其合成酶與再生酶活性增強(qiáng)有關(guān)。

本試驗(yàn)（采用改良空氣干旱法模擬干旱脅迫）所觀察到的紫花苜蓿在干旱脅迫下3種生理物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化與前人[15,17-18]研究結(jié)果一致,說明改良空氣干旱法模擬干旱脅迫效果明顯且不產(chǎn)生滲透脅迫,可以作為一種模擬方法選用。

[1]陳文新.豆科植物根瘤菌-固氮體系在西部大開發(fā)中的作用[J].草地學(xué)報(bào),2004,12（1）：1-2.

[2]楊世琦,孫兆敏,楊雄平.發(fā)展苜蓿草產(chǎn)業(yè)促進(jìn)西北干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003,12（4）：157-160.

[3]吳洋,李清明,鄒志榮,等.CO2濃度倍增和干旱脅迫對(duì)黃瓜幼苗葉片轉(zhuǎn)化酶活性及糖代謝的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2008,36（10）：121-126.

[4]石永紅,萬里強(qiáng),劉建寧,等.干旱脅迫對(duì)6個(gè)坪用多年生黑麥草品種抗旱性的影響[J].草地學(xué)報(bào),2009,17（1）：52-57.

[5]余玲,王彥榮,Garnett T,等.紫花苜蓿不同品種對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2006,15（3）：75-85.

[6]Pavet V,Olmos E,Kiddle G,et al.Ascorbic acid deficiency activates cell death and disease resistance responses in arabidopsis[J].Plant Physiology,2005,139：1291-1303.

[7]Antolin M C,Yoller J,Sanchez D M.Efforts of temporary drought on nitrate-fed and nitrogen-fixing alfalfa plants[J].Plant Science,1995,107：159-165.

[8]Shao H B,Chen X Y,Chu L Y,et al.Investigation on the relationship ofproline with wheatantidrought under soil water deficits[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,2006,53（1）：113-119.

[9]王海寧,張建利,馮林,等.溫度和干旱脅迫對(duì)3種牧草種子萌發(fā)的影響[J].草業(yè)科學(xué),2009,26（8）：87-92.

[10]唐紅,孫吉雄,李福源,等.干旱脅迫對(duì)青海游憩草地質(zhì)量的影響[J].草業(yè)科學(xué),2009,26（6）：159-165.

[11]萬里強(qiáng),石永紅,李向林,等.高溫干旱脅迫下三個(gè)多年生黑麥草品種葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18（1）：25-31.

[12]陳少裕.膜脂過氧化與植物逆境脅迫[J].植物學(xué)通報(bào),1989,6（4）：211-217.

[13]馬春花.干旱脅迫和衰老過程中蘋果抗壞血酸代謝的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

[14]李文嬈,張歲歧,山侖.苜蓿葉片及根系對(duì)水分虧缺的生理生化響應(yīng)[J].草地學(xué)報(bào),2007,15（4）：299-305.

[15]王文斌,金潤(rùn)熙,鄧西平,等.苜蓿幼苗芽、根器官對(duì)鹽脅迫的生理生化響應(yīng)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2009,37（5）：217-223.

[16]呂長(zhǎng)平,石雪暉,楊國(guó)順,等.水分脅迫對(duì)草莓葉片SOD活性以及MDA和Vc含量的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,22（5）：451-455.

[17]Davey M W,Van Montagu M,Inzé D,et al.Plant L-ascorbic acid：Chemistry,function,metabolism,bioavailability and effects of processing[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2000,80：825-860.

[18]賈根良,代惠萍,馮佰利,等.PEG模擬干旱脅迫對(duì)糜子幼苗生理特性的影響[J].西北植物學(xué)報(bào),2008,28（10）：2073-2079.