Caveolin－1在大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用*

王留東，趙二義，文全慶，關(guān)文娟，魯晶晶，彭 濤，張博愛，賈延劼

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在組織工程、細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域有十分廣闊的應(yīng)用前景[1]。雖然可以采用多種方法誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞，但其分化機(jī)制尚不清楚。隨著膜細(xì)胞化學(xué)研究的深入，很多報道發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上的特殊結(jié)構(gòu)－脂筏(lipid raft)在干細(xì)胞生長、分化中起到重要作用[2，3]。本研究以脂筏的標(biāo)記蛋白 caveolin－1為參照，結(jié)合RNA干擾技術(shù)，通過觀察caveolin－1在大鼠MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化，初步探討脂筏在MSCs分化中的作用。

材料和方法

1 動物

SPF級成年Wistar大鼠，8－12周，體重200－300 g，由河南省實驗動物中心提供。常規(guī)從大鼠股骨中分離提取MSCs，連續(xù)傳10代以上的細(xì)胞置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)基、B27、胎牛血清購自Gibco;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自 PeproTechEc;caveolin －1、神經(jīng)元烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)、神經(jīng)微絲亞單位(neurofilament subunit，NF － M)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)兔抗多克隆抗體購自Santa Cruz;FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司;大鼠Rn－caveolin－1－siRNA、陰性對照siRNA(Cy3標(biāo)記)、陽性對照Rn－MAPK1(mitogen activated protein kinase 1)control siRNA、轉(zhuǎn)染試劑 HiPerFect、RNeasy Mini試劑盒、Qiagen? OneStep RT－PCR試劑盒均為 Qiagen產(chǎn)品;β－巰基乙醇、噻唑藍(lán)(MTT)購自Sigma;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海生物工程公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

表1 引物序列Table1.Primer sequence

3 主要方法

3.1 實驗分組 取培養(yǎng)第10代以上的MSCs復(fù)蘇，按照2×106cells/well的比例接種于12孔培養(yǎng)板，置于37℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率為50%－70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗根據(jù)轉(zhuǎn)染的不同，選擇同時點的MSCs分為4組，即正常對照組(未轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染 Rn－caveolin－1－siRNA)、陽性對照組(轉(zhuǎn)染Rn－MAPK－1 control siRNA)和陰性對照組(轉(zhuǎn)染negative control siRNA)。

3.2 大鼠MSCs轉(zhuǎn)染 按照Qiagen公司的實驗說明操作。在每孔加入1.1 mL培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，雙抗)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。同時，分別將300 ng siRNA(Rn－caveolin－1－siRNA、Rn－MAPK1 control siRNA、negative control siRNA)溶于100 μL DMEM 培養(yǎng)基，再加入6.0 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑，混勻;室溫孵育10 min后;將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入含MSCs孔內(nèi)，使siRNA的終濃度達(dá)到20 mol/L，孵育24－72 h。正常對照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其它培養(yǎng)條件同各轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察陰性對照negative control siRNA轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h觀察 MSCs熒光表達(dá)情況，評價細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

3.3 體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞 參照我們的方法[4]，取各組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)實驗。D－Hanks液清洗3次，加入預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，10 μg/L bFGF)培養(yǎng)24 h。預(yù)誘導(dǎo)后，加入誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基，200－400μmol/L β－巰基乙醇)誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)后加入維持液(DMEM培養(yǎng)基，200－400 μmol/L β － 巰基乙醇，10 μg/L bFGF，B27)繼續(xù)維持6 d。

3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將各組細(xì)胞用PBS清洗之后，迅速經(jīng)4%多聚甲醛固定液4℃固定20 min，0.2%Triton X －100處理10 min，并用 10%牛血清白蛋白封閉1 h。然后分別用caveolin－1抗體(2.0 mg/L)、NSE 抗體(1.0 mg/L)、NF － M(1.0 mg/L)、GFAP(1.0 mg/L)4 ℃孵育 24 h。用 PBS 洗3遍后，用FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500)在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記、觀察。細(xì)胞圖像通過顯微鏡用10×或20×攝取，圖像均采用300 dpi分辨率。每組獨立的實驗都會采集超過20個區(qū)域的細(xì)胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細(xì)胞數(shù)目。采用雙人雙盲隨機(jī)記數(shù)陽性細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分比例。

3.5 RT－PCR法 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照Qiagen? OneStep RT－PCR試劑盒實驗操作說明進(jìn)行RT－PCR，總反應(yīng)體積50 μL，其中5×Qiagen OneStep RT－PCR buffer 10.0 μL，dNTP mix 2.0 μL，Qiagen OneStep RT － PCR enzyme mix 2.0 μL，5 × Q － solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA1.0 μg，引物 0.6μmol/L。擴(kuò)增條件為:50℃ 30 min，95℃ 15 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30－35個循環(huán)，72℃10 min。然后，取RT－PCR 產(chǎn)物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實驗結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(GelPro Analyzer Version 3.0)分析各目的基因與β－actin基因條帶吸光度值。

3.6 細(xì)胞存活率檢測(MTT法) 采取四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，按照轉(zhuǎn)染前、后各個相同時點，將各組的MSCs轉(zhuǎn)至96孔板，加MTT(5.0 g/L)50 μL/well、置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，離心棄上清，再加入二甲基亞砜200 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇490 nm波長，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值，評價各組細(xì)胞存活率。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有的圖形由ImagePro Plus 6.0軟件采集和處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用Graph-Pad Prism 5.01作圖，并根據(jù)不同要求進(jìn)行方差分析和χ2檢驗。

結(jié) 果

1 大鼠MSCs轉(zhuǎn)染

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)變化不顯著，僅見少數(shù)細(xì)胞脫落、胞體收縮呈球形或梭形。采用Cy3標(biāo)記的陰性對照(negative control)siRNA評估，大鼠 MSCs 24 h、48 h、72 h 的轉(zhuǎn)染率分別為(50.5 ±5.2)%、(70.5 ±6.5)% 和(81.5 ± 2.8)%，見圖 1。進(jìn)一步采用RT－PCR驗證，正常對照組MSCs可以表達(dá)caveolin－1mRNA、MAPK1 mRNA，轉(zhuǎn)染組 MSCs表達(dá)caveolin－1mRNA顯著降低(P＜0.01)，陽性對照組MAPK1 mRNA表達(dá)也顯著減弱(P＜0.01)，而陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組間差異無顯著，見表2。此外，轉(zhuǎn)染前、后各組MSCs的MTT結(jié)果無顯著差異(P＞0.05)，見表3。

2 體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞

Figure1.Cy3 labeled negative control group:72 h after negative control siRNA transfection(×200).A:inverted microscope;B:fluorescence microscope.圖1 Cy3標(biāo)記的陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染72 h

表2 RT－PCR結(jié)果Table2.The effect of RT－PCR(%..n=12)

表2 RT－PCR結(jié)果Table2.The effect of RT－PCR(%..n=12)

＊＊P ＜0.01 vs other groups.

Group Caveolin－1mRNA MAPK1 mRNA Non － transfection 0.677 ±0.023 0.908 ±0.025 Transfection 0.218 ±0.028＊＊ 0.865 ±0.035 Positive control 0.702 ±0.048 0.306 ±0.042＊＊Negative control 0.698 ±0.040 0.868 ±0.015

表3 各組的MSCs的MTT值Table3.The MTT value of MSCs in groups(%..n=12)

表3 各組的MSCs的MTT值Table3.The MTT value of MSCs in groups(%..n=12)

Group Before induction 24 h after induction 72h after induction Non－transfection 0.750 ±0.036 0.745 ±0.020 0.740 ±0.026 Transfection 0.747 ±0.048 0.720 ±0.032 0.715 ±0.028 Positive control 0.738 ±0.023 0.712 ±0.022 0.728 ±0.032 Negative control 0.736 ±0.024 0.710 ±0.031 0.726 ±0.022

正常對照組誘導(dǎo)6 d，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞改變，胞體呈多角形或圓形，周圍有光暈，突起細(xì)長，有數(shù)個分支，部分細(xì)胞在局部形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)染Rncaveolin－1－siRNA組誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化更加顯著，誘導(dǎo)24 h，部分細(xì)胞向具有神經(jīng)細(xì)胞特點的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞體逐漸變成圓形或錐形，折光性增強(qiáng)，胞體周圍有較強(qiáng)的光暈，胞體伸展的突起繼續(xù)延長，局部區(qū)域相互交織成網(wǎng)，誘導(dǎo)6 d，形成具有典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見圖2。陽性和陰性對照組形態(tài)學(xué)變化與正常對照組類似。

Figure2.MSCs of Rn－caveolin－1－siRNA group were induced into neurons(6 h after induction，×200).圖2 Rn－caveolin－1－siRNA組誘導(dǎo)6 d向神經(jīng)細(xì)胞分化

本研究選擇NSE、NF－M和GFAP蛋白鑒定分化后細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前MSCs不表達(dá)上述蛋白。誘導(dǎo)6 d，各組均程度不等表達(dá)NSE和NF－M。其中，轉(zhuǎn)(77.84±3.58)%，顯著的高于其它各組P＜0.05，見圖3。但是各組GFAP表達(dá)率均小于5%，無顯著差異，見表4。

3 Caveolin－1的表達(dá)變化

誘導(dǎo)前，正常對照組大鼠MSCs的細(xì)胞膜上可以表達(dá)caveolin－1。誘導(dǎo)6 h，caveolin－1開始表達(dá)增強(qiáng)，與誘導(dǎo)前相比差異顯著(P＜0.05);而且隨時間延長表達(dá)持續(xù)增加，峰值在誘導(dǎo)6 d，與誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)6 h相比差異顯著(P＜0.01)。陽性對照組和陰性對照組也有類似的結(jié)果，見表5。

Figure3.MSCs of Rn－caveolin－1－siRNA group were induced into neurons(6 h after induction，×200).The result observed under inverted microscope(A)and expression of NF－M observed under fluorescence microscope(B).圖3 Rn－caveolin－1－siRNA組誘導(dǎo)6 d向神經(jīng)細(xì)胞分化及NF－M表達(dá)

表4 誘導(dǎo)6 d各組細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果Table4.The immunocytochemistry stain effect(6d after induction)(%..n=6×103cells)

表4 誘導(dǎo)6 d各組細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果Table4.The immunocytochemistry stain effect(6d after induction)(%..n=6×103cells)

＊＊P ＜0.01 vs other groups.

Group NSE NF－M GFAP Non － transfection 62.90 ±3.71 63.77 ±3.80 2.4±0.900 ±0.85 Transfection 81.49 ±3.07＊＊ 77.84 ±3.58＊＊ 2.60 ±0.84 Positive control 64.18 ±3.92 59.21 ±3.93 2.82 ±0.91 Negative control 63.84 ±2.71 59.56 ±4.04 3.07

Rn－caveolin－1－siRNA轉(zhuǎn)染后，MSCs細(xì)胞膜上的 caveolin－1表達(dá)顯著降低，僅為(28.53±5.00)%。誘導(dǎo)6 h，caveolin－1的表達(dá)也有增強(qiáng)的趨勢，但是與誘導(dǎo)前相比無顯著差異(P＞0.05);同樣誘導(dǎo)6 d時，caveolin－1的表達(dá)顯著增加，達(dá)到(33.84±5.91)%，與誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)6 h相比顯著差異，P＜0.05，見圖4。此外，Rn－caveolin－1－siRNA轉(zhuǎn)染后與其它各組同時點的caveolin－1表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。

表5 各組細(xì)胞caveolin－1免疫化學(xué)染色結(jié)果Table5.The immunocytochemistry staining of caveolin－1(%..n=6×103cells)

表5 各組細(xì)胞caveolin－1免疫化學(xué)染色結(jié)果Table5.The immunocytochemistry staining of caveolin－1(%..n=6×103cells)

#P ＜0.05 vs 6 d after induction;＊＊P ＜0.01 vs other groups.

Group Before induction 6 d after induction Non －transfection 69.27 ±6.09# 74.11 ±4.59#6 h after induction 78.55 ±3.04 Transfection 28.53 ±5.00#＊＊ 30.21 ±2.50#＊＊ 33.84 ±5.91＊＊Positive control 68.68 ±5.24# 73.60 ±3.65# 78.51 ±3.15 Negative control 69.05 ±4.33# 74.09 ±4.50#79.46 ±3.21

Figure4.MSCs of Rn－caveolin－1－siRNA group were induced into neurons(6 h after induction，×400).The result observed under inverted microscope(A)and expression of caveolin－1 observed under fluorescence microscope(B).圖4 Rn－caveolin－1－siRNA組誘導(dǎo)6 d向神經(jīng)細(xì)胞分化及caveolin－1表達(dá)

討 論

體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞是一個復(fù)雜的多信號、多通路的過程，其機(jī)制尚不清楚[5－7]。雖然很多誘導(dǎo)劑(如β－巰基乙醇、神經(jīng)營養(yǎng)因子、中藥等)可以通過不同的途徑激活不同的信號通路，但是幾乎所有的誘導(dǎo)劑作用起點都是細(xì)胞膜。因此，探索MSCs體外誘導(dǎo)過程中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化，有助于對其分化機(jī)制的理解。

目前認(rèn)為，細(xì)胞膜表面存在一種特殊的結(jié)構(gòu)－脂筏，參與轉(zhuǎn)運、內(nèi)吞、內(nèi)化、鈣的動態(tài)平衡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列細(xì)胞過程[2，8]。在脂筏中，有一種特殊類型的脂筏－小凹(caveolae)，主要存在于上皮和內(nèi)皮細(xì)胞膜上的許多小的瓶狀內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，其胞質(zhì)面由一層膜外衣覆蓋，這層外衣的主要成分是小凹蛋白(caveolin)家族，分子量為21－25 kD，屬整合蛋白，其中caveolin－1是分離膜上特化區(qū)域的標(biāo)記蛋白，也是脂筏的重要標(biāo)記蛋白之一[9]。本研究結(jié)果提示，大鼠MSCs可以表達(dá) caveolin －1，與 Park 的結(jié)果類似[10]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，caveolin－1在干細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮樞紐作用，多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號分子均集中于此。如caveolin－1可以與galectin－1、表皮生長因子等相互作用，通過 Src、Eras、Akt和mTOR等信號通路，影響胚胎干細(xì)胞的增殖和遷移[11，12]。如果基因敲除了 caveolin －1，可以促進(jìn)小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，caveolin－1在體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的過程中起到兩方面作用:(1)作為一個通用的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，抑制許多信號通路的基礎(chǔ)活性，如Notch通路、胰島素樣生長因子1受體通路[14，15]。Notch通路是一個多步驟、多因素參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[4]，caveolin－1可以整合 β1－integrin、Notch－1、酪氨酸激酶受體通路的相互作用。β1－integrin能通過 caveolin－1影響Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的轉(zhuǎn)運，進(jìn)而影響Notch－1信號通路;而且，在這種協(xié)同作用下，兩者調(diào)控表皮生長因子受體通路(另一條重要的神經(jīng)細(xì)胞分化通路)，實現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞分化的精細(xì)調(diào)節(jié)[15，16]。本研究采用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)caveolin－1的表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白NSE、NF－M的表達(dá)顯著增加，促進(jìn)了MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，可能與此有關(guān)。(2)caveolin－1并不單純是一個信號分子的抑制劑，其對某些信號過程中也可起促進(jìn)作用[17]。如本研究發(fā)現(xiàn)，無論是否轉(zhuǎn)染Rn－caveolin－1－siRNA，隨誘導(dǎo)時間的延長caveolin－1的表達(dá)持續(xù)增加，當(dāng)誘導(dǎo)6 d時達(dá)到峰值，與誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)6 h相比，均有顯著差異，揭示了caveolin－1表達(dá)變化在此過程中的復(fù)雜性。

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