李新蘭 徐 穎 潘冬瑞 張 亮 郭志勇 鄒 坤

(三峽大學天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室,湖北宜昌 443002)

紅樹林是生長在熱帶及亞熱帶海岸潮間帶一大類特殊的植物,具有耐鹽,耐淹等特性,特別是在漲潮期間能為許多海洋動物提供食物及庇護場所,形成一類非常特別的生態(tài)系統(tǒng).正因為紅樹林奇特的環(huán)境造就寄生其中的微生物能夠產(chǎn)生具有各種活性的不同代謝產(chǎn)物,林永成等從紅樹林內(nèi)生真菌中分離到一系列結構新穎活性好的化合物[1-6].在從紅樹林內(nèi)生真菌中尋找抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物過程中,發(fā)現(xiàn)紅樹林內(nèi)生真菌Paecilomyces sp.(tree1-7)的粗提物具有較強的抗腫瘤活性.在進一步分離過程中分離得到Tetracenomycin D,Physcioin,Emodin,1,4-Dihydroxy-2-methy anthraquinone和Chrysophanol等5個蒽醌類衍生物,同時用MT T法評價其對鼻咽癌細胞KB和KBv細胞的活性.

1 實驗部分

1.1 試劑與實驗儀器

X-4數(shù)字顯示顯微熔點儀(溫度未校正)(北京泰克儀器有限公司);Bruker DRX-500核磁共振波譜儀;Finnigin電噴霧質(zhì)譜儀;Varian prostar高效液相色譜儀;AL204電子天平(MET T LWR TOLEDO);S-3100紫外分光光度計(SCINCO);N-1001型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)等.柱色譜和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品,其它試劑均為分析純.

1.2 菌種

Tree 1-7菌株是采自中國臺灣海峽紅樹林的樹皮腐生真菌,屬Paecilomycessp.,鮮黃色密集型生長.由廈門大學鄭忠輝教授提供,菌種分別保存在廈門大學化學化工學院和中山大學化學與化學工程學院天然產(chǎn)物研究室內(nèi).保存在 4℃的PDA+2.0%NaCl的培養(yǎng)基中.

1.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

采用懸浮培養(yǎng)方式:發(fā)酵培養(yǎng)基(w)為葡萄糖0.5%,蛋白胨0.1%,酵母膏 0.05%,粗海鹽0.2%,pH 7.0,500 mL三角瓶內(nèi)裝培養(yǎng)液 300 mL,經(jīng)121℃(0.1MPa)高溫滅菌25min后在超凈工作臺上接種.共接種150 L,28℃靜置培養(yǎng)40d.

1.4 提取分離

發(fā)酵液用紗布過濾,菌體和發(fā)酵液分別收集,發(fā)酵液濃縮,150 L濃縮至5 L,用乙酸乙酯萃取.菌體曬干,甲醇浸泡后濃縮,提取濃縮物分別拌硅膠過柱,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗.收集各組分再反復柱層析,制備薄層層析,HPLC和重結晶純化,分別得到化合物1～7.

1.5 抗癌活性實驗

用MT T法檢測5個蒽醌類化合物對KB和KBv細胞的細胞毒活性.從母液開始,依次4倍稀釋,共5個梯度.對數(shù)生長期的KB和KBv細胞分別接種于96孔板,每孔100μ L(約1×104個細胞/孔),6h后加入不同濃度藥物100 μ L,每一濃度3個重復孔.培養(yǎng)24 h后加入MT T 10 μ L(質(zhì)量濃度為 5 mg/mL).繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,每孔加入二甲基亞砜100μ L后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定492 nm處吸光度OD值,計算細胞生長抑制率.細胞生長抑制率=(實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%.KB和KBv細胞的細胞毒實驗由中山大學醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院的符立梧教授測試.

2 結果與討論

2.1 結構解析

化合物1為紅色固體,熔點210～212℃.EI-MS(M+):350.其一維氫譜碳譜明顯顯示出醌類的特征.其一維氫譜中在高場區(qū)僅有δ 3.95,2.37ppm的甲氧基和甲基,芳香質(zhì)子的δ7.69,7.52,7.42,7.14,6.71 ppm,活潑羥基的δ13.35,12.44,12.35ppm.而其一維碳譜除了δ55.9,25.0 ppm的甲氧基和甲基外其它的均在芳香區(qū)和不飽和酮羰基的碳信號.其中芳香區(qū)的氫的偶合常數(shù)只有3.3,2.4 Hz,這說明δ 7.69,7.52ppm的氫是間位的,同樣的7.42,6.71ppm也是間位的.通過與文獻數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)化合物1與tetracenomycin D的光譜數(shù)據(jù)一致.Tetracenomycin類化合物是1979年 Weber H[7]等人從 sreptomyces glaucescens中分到一系列的衍生物.這類化合物具有好的抑制微生物生長及抑制腫瘤細胞的活性而受到化學家的廣泛關注.Careron D W[8]等于1992年合成了tetracenomycin及衍生物.

化合物2為橙紅色固體,熔點202～203℃,EIMS譜給出分子離子峰m/e 284[M]+,結合氫譜和碳譜,推出其分子式為C16H12O5,計算不飽和度為11.碳譜提示存在 10個季碳(其中2個羰基碳),4個CH,2個CH3.具有典型的蒽醌骨架特征,并解釋了所有不飽和度.氫譜中2個甲基均為單峰δ3.94(s,3H),2.45(s,3H),在 δ7.63(dd,1.5,0.5 Hz,1H),7.37(d,2.5 Hz,1H),7.08(dd,2.5,1.0 Hz,1H),6.69(d,2.5Hz,1H)ppm出現(xiàn)的4個芳香質(zhì)子之間的偶合常數(shù)比較小,表明它們之間是遠程相關,應處于間位.另外在δ12.31(s,1H)和12.11(s,1H)ppm出現(xiàn)2個酚羥基質(zhì)子,信號比較強,提示它們與羰基之間形成了氫鍵,綜合解析譜圖得出化合物2的結構.大黃素甲醚(physcioin)的熔點文獻值分別為209～210℃[9]和 197～ 198℃[10],與本化合物 202～203℃比較吻合,進一步對比其氫譜和碳譜,確證其結構與大黃素甲醚一致.大黃素甲醚是常用中藥大黃的主要有效成分之一.大黃具有清熱瀉下作用,內(nèi)服治療腸胃積滯、大便不通,外用治療燒傷并具有較強抑菌作用.

化合物3為橙色針狀結晶,熔點256～257℃,分子式為C15H10O5,EI-MS顯示分子量為270,由菌體中得到,易溶于CHCl3,EtOAc與CH3OH,幾乎不溶于乙醇及堿溶液.從氫譜中可以看出有兩個螯合的羥基 δ 12.17,12.05ppm,一個羥基在 δ 10.18 ppm,兩組間位的芳香氫取代δ 7.55,7.12 ppm與δ 7.24,6.65 ppm,及一個苯環(huán)上取代的甲基δ 2.47ppm.碳譜中有兩個明顯的羰基峰δ 192.5,182.9 ppm.通過與文獻[11]對照NM R數(shù)據(jù),證明是大黃素(9,10-蒽二酮).大黃素首次由Penicillium spp.中分離得到,并且近期報道在Cascara sagrada中也分離得到.是一種很好的抗菌劑,抗腫瘤藥及通便藥,它還顯示抑制一元胺氧化酶活性,并且它的危險性和毒性是 LD50=35 mg/kg[9].

化合物4為橙紅色固體,熔點為 178～179℃,其EI-MS顯示其分子量為254.其氫譜中低場區(qū)有2個活潑氫的信號分別為δ 12.11,12.00 ppm,表明該羥基有可能與γ-位羰基形成氫鍵,在芳香質(zhì)子信號區(qū)有5個質(zhì)子信號 δ 7.83(dd,0.9,7.5,1H),7.65(m,2H),7.29(dd,1.2,8.4,1H),7.10(s,1H),可以看出該化合物有一個鄰二取代的苯環(huán)和一個五取代苯環(huán)存在.其高場區(qū)僅有一個連苯環(huán)的甲基存在.在其碳譜中顯示出 15個碳,其中有 5個 CH,一個CH3,這與其一維氫譜是一致的,還有 9個季碳,其中 δ 192.37,181.81 ppm的季碳可能是兩個與苯環(huán)共軛的羰基,推測其有可能是一個蒽醌類化合物.還有δ 162.59,162.30 ppm的季碳表明其中苯環(huán)上有兩個連有羥基的碳存在.其它的季碳均在芳香區(qū)更加確定了化合物4是一個蒽醌類化合物.與文獻[11]對照確定其結構如圖所示.因為該化合物具有抗腫瘤活性及抑制多種微生物的活性,Singh Ram[12]等合成了化合物4,并研究了藥理活性與結構的關系.

化合物5是金黃色固體.由菌體中得到,易溶于CHCl3,EtOAc與CH3OH.從氫譜中可以看出有兩個螯合的羥基δ 12.11,12.00 ppm,一組間位的芳香氫δ 7.65,7.09 ppm,及3個鄰位的芳香氫δ 7.81,7.65,7.09 ppm及一個苯環(huán)上取代的甲基δ 2.48 ppm.碳譜中有兩個明顯的羰基峰δ 192.4,181.8 ppm.與已知化合物chrysophanol相比,他們有相同的NMR數(shù)據(jù).Chrysophanol由Monilinia fructicola中分離得到,是一種很好的抗菌劑,通便藥[13].

化合物6為一白色針狀晶體,熔點198～199℃.其一維譜顯示該化合物是甾醇類結構.與麥角甾醇的氫譜比較發(fā)現(xiàn)就是在δ 2.03ppm處多了一個甲基,而碳譜的區(qū)別在于多了δ 170.3,30.5ppm.據(jù)此推斷6可能是乙?；柠溄晴薮?與文獻對比確定化合物6就是乙?；柠溄晴薮糩14].

化合物7:白色晶體,mp:246～248℃.T LC與標準品三羥基麥角甾醇對比是同一化合物.

圖1 化合物1-7的結構

2.2 抗癌活性

通過M TT法測試5個蒽醌類化合物可以抑制鼻咽癌細胞(KB,KBv)的活性,結果顯示蒽醌化合物1-5對鼻咽癌細胞有不同程度的抑制活性.

表1 化合物1-5對KB及KBv活性數(shù)據(jù)

2.3 化合物的物理和波譜數(shù)據(jù)

化合物1實驗數(shù)據(jù):紅色固體,mp 210～212℃.EI-MS:350;1H NMR(300 MHz,CDCl3):13.35(br s,1H),12.44(br s,1H),12.35(br s,1H),7.69(d,3.3,1H),7.52(d,3.3,1H),7.42(d,2.4,1H),7.14(s,1H),6.71(d,2.4,1H),3.95(s,3H),2.37(s,3H).13C NMR(75 MHz,CDCl3):185.0(C),182.2(C),165.5(C),162.9(C),162.2(C),157.6(C),139.2(C),136.1(C),129.5(C),126.9(C),127.6(C),125.7(C),116.8(CH),116.1(CH),114.7(CH),106.8(CH),105.4(CH),55.9(CH3),25.0(CH3).

化合物2:橙紅色固體,mp 202～203℃,EI-MS(m/z):285[M+H]+;13C NMR(CDCl3,75 MHz):190.8(s),182.0(s),166.6(s),165.2(s),162.5(s),148.4(s),135.3(s),133.2(s),124.5(d),121.3(d),113.7(s),110.3(d),108.2(s),106.8(d),56.1(q),22.1(q);1H NMR(CDCl3,300 MHz):12.31(s,1H),12.11(s,1H),7.63(dd,1.5,0.5 Hz,1H),7.37(d,2.5Hz,1H),7.08(dd,2.5,1.0Hz,1H),6.69(d,2.5 Hz,1H),3.94(s,3H),2.45(s,3H);IR(KBr)ν:3432,3333,3130,1639,1613,1453,1401,1326,1273,1226,1163,1099,874,850,758 cm-1;UV(CH3COCH3)λ max:212,284,324,433 nm.

化合物3:橙色針狀結晶.mp 251～253℃.1H NMR(Acetone-d6,300 MHz):12.17(1H,s),12.05(1H,s),10.18(1H,s),7.55(1H,d,J=1.2 Hz),7.24(1H,d,2.4 Hz),7.12(1H,d,0.6 Hz),6.65(1H,d,2.4 Hz),2.47(3H,s);13C NMR(Acetoned6,75 MHz):192.5,182.9,167.1,167.1,164.1,150.4,137.5,135.12,125.8,122.3,118.1,115.4,110.5,109.8,23.0.

化合物4:橙紅色固體,mp178～179℃,EI-MS:254;1H NM R(300 MHz,CDCl3):12.11(s,1H),12.00(s,1H),7.83(dd,0.9,7.5,1H),7.65(m,2H),7.29(dd,1.2,8.4,1H),7.10(s,1H),2.48(s,3H);13C NMR(75MHz,CDCl3):192.4(C),181.8(C),162.6(C),162.3(C),149.2(C),136.8(CH),133.6(C),133.2(C),124.5(CH),124.3(CH),121.3(CH),119.9(CH),115.8(C),113.7(C),22.4(CH3).

化合物 5:金黃色固體.mp 199～200℃,1H NMR(CDCl3,300MHz):12.11(1H,s),12.00(1H,s),7.81(1H,d,6.6 Hz),7.65(2H,m),7.28(1H,d,7.5 Hz),7.09(1H,s),2.48(3H,s);13C NMR(CDCl3,75 MHz):192.4,181.8,162.6,162.3,149.2,136.8,133.6,133.3,124.5,124.3,121.3,119.8,115.9,113.7,22.8.

化合物6:1H NMR(CDCl3,300MHz):5.36(m,1H),5.24(dd,8,15 Hz,1H),5.17(dd,7.5,15 Hz,1H),4.11(m,1H),3.63(m,1H),2.03(s,3H),1.08(s,3H),1.02(d,7Hz,3H),0.91(d,7Hz,3H),0.84(d,7.5Hz,3H),0.82(d,7.5Hz,3H),0.60(s,3H);13C NMR(CDCl3,75MHz):δ170.3(C),141.9(C),135.1(CH),131.3(CH),118.1(CH),74.4(C),72.0(CH),65.9(CH),55.3(CH),54.1(CH),42.9(C),42.2(CH),41.9(CH),40.1(CH2),39.8(CH),38.9(CH2),36.6(C),32.4(CH),31.1(CH2),30.5(CH3),27.5(CH2),22.5(CH2),21.2(CH2),20.8(CH3),19.6(CH3),19.3(CH3),17.5(CH3),17.2(CH3),11.9(CH3).

化合物7:EI-MS m/z 413[M+1-H2O]+,395,377,341,307,227;IR(KBr)υmax(cm-1):3610,3442,2956,2870,1657,1457,1381,1310,1256,1163,1107,1030,967 cm-1;1H NMR(CDCl3,300 MHz):δ 5.36(m,1H),5.24(dd,8,15Hz,1H),5.17(dd,7.5,15Hz,1H),4.11(m,1H),3.63(m,1H),1.08(s,3H),1.02(d,7 Hz,3H),0.91(d,7 Hz,3H),0.84(d,7.5Hz,3H),0.82(d,7.5Hz,3H),0.60(s,3H).13C NMR(CDCl3,75MHz):δ141.9(C),135.1(CH),131.3(CH),118.1(CH),74.4(C),72.0(CH),65.9(CH),55.3(CH),54.1(CH),42.9(C),42.2(CH),41.9(CH),40.1(CH2),39.8(CH),38.9(CH2),36.6(C),32.4(CH),31.1(CH2),27.5(CH2),22.5(CH2),21.2(CH2),20.8(CH3),19.6(CH3),19.3(CH3),17.5(CH3),17.2(CH3),11.9(CH3).

3 結 語

綜合文獻及本實驗的研究結果表明:紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物具有化學結構新穎,良好的抗腫瘤活性,具有潛在的藥用價值和良好的開發(fā)前景.

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