張 斌，唐建華，謝洪平

（蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

石墨烯(Graphene)是碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀（honeycomb）晶格結(jié)構(gòu)的一種炭質(zhì)新材料［1,2］，碳原子排列與石墨的單原子層一樣.這種石墨晶體薄膜的厚度只有0.335nm，厚度僅為頭發(fā)的20萬分之一，是構(gòu)建其他維數(shù)炭質(zhì)材料（如零維富勒烯、一維碳納米管、三維石墨）的基本單元，具有極好的結(jié)晶性及電學(xué)質(zhì)量和非凡的電子學(xué)、熱力學(xué)和力學(xué)性能.石墨烯自2004年由英國曼徹斯特大學(xué)的Geim等［3］利用膠帶剝離高定向熱裂解石墨的方法獲得后，引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注和極大的興趣，被預(yù)測(cè)很有可能在很多領(lǐng)域引起革命性變化.氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化物，因表面具有羥基、羧基等親水性基團(tuán)而具有良好的水溶性，同時(shí)也便于功能化和應(yīng)用.已有報(bào)道，GO作為抗癌藥物喜樹堿的類似物SN38的載體［4］以及GO結(jié)合功能分子卟啉用于Ca2+的快速分析［5］等應(yīng)用.然而，GO定量結(jié)合藥物或各種功能分子的報(bào)道還很少.亞甲藍(lán)(Methyleneblue，MB)是一種吩噻嗪類染料，化學(xué)名為氯化3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓三水合物，結(jié)構(gòu)式為C16H18ClN3S·3H20.臨床上用作氰化物和亞硝酸鹽中毒的解毒劑，也是光化學(xué)法滅活新鮮單袋血漿中病毒的光敏劑.在有關(guān)吸附劑的吸附特性的表征中，染料也常作為模型吸附質(zhì)，如吸附劑的吸藍(lán)量就是指其對(duì)亞甲藍(lán)的飽和吸附量.因此亞甲藍(lán)為吸附研究中最為常用的模型染料之一［6,7］.

本文采用改進(jìn)的Hummer法［4］制取氧化石墨烯，然后在蒸餾水中利用超聲分散將氧化石墨剝片得到GO.以MB為模型分子，采用紫外分光光度法考察GO對(duì)MB的載藥結(jié)合量，為GO結(jié)合具有紫外吸收的藥物分子或各種功能分子提供定量方法.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

UV-2401紫外-可見全波長掃描儀（日本島津公司），透射電子顯微鏡（BHV-55，日本理研電子公司），TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），KA-1000臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），EL104電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）.

石墨（固定碳含量99.9%，325目，青島恒銳密封制品廠），KMnO4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），H2SO4（95.0-98.0%，昆上金城試劑有限公司），H2O2（30.0%，上海聯(lián)試化工試劑有限公司），BaCl2(上海化專實(shí)驗(yàn)二廠)，HCl(36.0-38.0%，昆上金城試劑有限公司)，亞甲藍(lán)（生物染色劑，上海山浦化工有限公司），PBS緩沖溶液（0.02mol/L，pH7.33），其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為三次蒸餾水.

1.2 氧化石墨烯的制備

將1g石墨加入到裝有23ml濃H2SO4的圓底燒瓶中，機(jī)械攪拌12小時(shí).低溫條件下緩慢加入6g KMnO4后，將溫度升到40℃反應(yīng)30分鐘，再將溫度升到90℃反應(yīng)1.5小時(shí).緩慢連續(xù)加入46ml三蒸水，使溫度上升到98℃，在此溫度下維持25分鐘.然后加入140ml三蒸水和10ml 30%的H2O2，在H2O2作用下，懸浮液變成亮黃色.為了純化氧化石墨，先用5%的HCl反復(fù)洗滌，直至無硫酸根離子（用BaCl2溶液檢測(cè)），再用三蒸水充分洗滌至近中性.將純化后的氧化石墨超聲2小時(shí)，然后離心3000rpm 30分鐘，上層即為GO.

1.3 氧化石墨烯結(jié)合亞甲藍(lán)

1.3.1 溶液配制

精密稱取MB 0.1160g(約310.2μmol)，置于1000ml的容量瓶中，用PBS緩沖溶液溶解并稀釋至刻度，配成310.2μmol/L的儲(chǔ)備液，避光、密封保存.

1.3.2 亞甲藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用MB儲(chǔ)備液和PBS緩沖溶液分別配制含MB 1.85μg/ml、2.31μg/ml、2.75μg/ml、3.24μg/ml、3.70μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于665nm處測(cè)定其吸光度，以吸光度值A(chǔ)對(duì)濃度C作圖.

1.3.3 游離亞甲藍(lán)的含量測(cè)定

將MB儲(chǔ)備液按不同倍數(shù)稀釋，得到一系列不同濃度的MB溶液.將制備的GO（1mg/ml）用PBS緩沖溶液稀釋成含GO 10μg/ml的溶液.將3ml不同濃度的MB溶液（1.93～58μg/ml）與3ml GO溶液（10μg/ml）分別加入8支具塞試管中，室溫振蕩2h，充分混勻.取出后高速離心12000rpm 15 min，以665nm作為檢測(cè)波長，測(cè)定各上清液的吸光度，平行測(cè)定3次，取平均值，由MB的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算平衡吸附液中游離的MB含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化石墨烯的表征

石墨烯的理論研究已有60多年的歷史，被廣泛用來描述不同結(jié)構(gòu)炭質(zhì)材料的性能.20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們開始認(rèn)識(shí)到石墨烯可以作為(2+1)維量子電動(dòng)力學(xué)的理想模型.但一直以來人們普遍認(rèn)為這種嚴(yán)格的二維晶體結(jié)構(gòu)由于熱力學(xué)的不穩(wěn)定性而難以獨(dú)立地穩(wěn)定存在.直到2004年，Geim等［3］用一種極為簡單的方法剝離并觀測(cè)到了單層石墨烯晶體，才引起了科學(xué)界新一輪的“碳”熱潮.同樣，GO也是單層二維晶體.對(duì)合成的GO用透射電鏡進(jìn)行表征，其結(jié)果見圖1.從圖1可以看出，GO表面并不平坦，而是有很多起伏和褶皺區(qū)域，正是這些區(qū)域才使得二維晶體能夠穩(wěn)定存在［8］.

圖1 氧化石墨烯的透射電鏡圖

2.2 亞甲藍(lán)檢測(cè)波長的選擇

由GO與MB的紫外吸收光譜（圖2）可看出，GO在230nm處有最大吸收峰，在300nm處有一個(gè)肩峰，這兩個(gè)特征吸收峰分別對(duì)應(yīng)芳香環(huán)C-C的π-π*躍遷和C=O的n-π*躍遷［9］.而MB在可見光區(qū)665nm處有強(qiáng)吸收峰，選擇此波長測(cè)定其含量具有較高的靈敏度，且GO在此波長處基本無吸收，不會(huì)對(duì)MB的測(cè)定造成干擾，因此選擇665nm作為GO吸附MB后對(duì)MB的檢測(cè)波長.

圖2 亞甲藍(lán)與氧化石墨烯的紫外吸收光譜1.MB（1.85μg/ml）；2.GO（11.76μg/ml）

圖3 亞甲藍(lán)濃度與吸光度的關(guān)系

2.3 亞甲藍(lán)檢測(cè)的線性范圍

以665nm處的吸光度值A(chǔ)對(duì)亞甲藍(lán)濃度C作線性回歸，回歸方程為A=0.2065C-0.05148，相關(guān)系數(shù)r=0.9999.結(jié)果顯示，亞甲藍(lán)濃度在1.85～3.70μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（見圖3）.

2.4 氧化石墨烯對(duì)亞甲藍(lán)的載藥性能

氧化石墨烯對(duì)亞甲藍(lán)的載藥性能用GO對(duì)MB的平衡吸附量進(jìn)行表征，即

其中，MGO為藥物載體GO的質(zhì)量（g），M0為加入研究體系的MB的量（mg），Mfree為平衡吸收后游離的MB的量(mg)，Qe即為GO對(duì)MB的平衡吸附量（即載藥量，mg/g）.其載藥量曲線參見圖4.

圖4 氧化石墨烯對(duì)亞甲藍(lán)的載藥量

從圖4可知：當(dāng)亞甲藍(lán)的初始濃度C0從0.967μg/ml升高至2.416μg/ml時(shí)，載藥量Qe從68.3mg/g升高至169.9mg/g，提高了近2.5倍.說明在亞甲藍(lán)濃度較低時(shí)，隨濃度C0的升高，氧化石墨烯對(duì)MB的載藥量有顯著的提高，這是由于氧化石墨烯具有大量的自由表位可供亞甲藍(lán)結(jié)合.

而隨著亞甲藍(lán)濃度C0的進(jìn)一步增加，氧化石墨烯表面的自由表位逐漸被亞甲藍(lán)占據(jù)，而總的表位是有限的，所以載藥量隨亞甲藍(lán)濃度升高而增加的程度逐漸變緩，即圖4中C0在2.416-9.667μg/ml范圍內(nèi)所表征的載藥情況.當(dāng)亞甲藍(lán)濃度從9.667到19.334μg/ml時(shí)，載藥量Qe從204.734增加到218.051mg/g，增加量極微，表現(xiàn)出了吸附平臺(tái)區(qū).因此，本文認(rèn)為C0=9.667μg/ml時(shí)的吸附量204.734mg/g即為飽和吸附量.

當(dāng)亞甲藍(lán)濃度C0從19.334μg/ml繼續(xù)升高時(shí)，吸附量顯著增加，但此時(shí)體系中能夠觀察到細(xì)微的絮狀沉淀.其原因可能是氧化石墨烯表面電離羧基所帶的負(fù)電荷幾乎完全被MB所中和，使溶液中GO保持穩(wěn)定分散的條件被破壞，由GO極大的表面積所導(dǎo)致的團(tuán)聚作用使其產(chǎn)生絮狀沉淀.團(tuán)聚顆粒通過非特異性的吸附作用，將溶液中游離的亞甲藍(lán)一并沉降下來，使上清液中所測(cè)得的亞甲藍(lán)含量偏低，造成載藥量出現(xiàn)繼續(xù)上升的結(jié)果.該類沉降現(xiàn)象不利于藥物生物利用度的提高，因此，GO對(duì)MB的最大載藥量認(rèn)為是C0=9.667μg/ml時(shí)的載藥量204.734mg/g，較通常的藥物載體表現(xiàn)出了一定的載藥優(yōu)勢(shì)［10］.

氧化石墨烯對(duì)亞甲藍(lán)所表現(xiàn)出的較理想的負(fù)載量，主要?dú)w因于它具有較大的比表面積，通過氫鍵、π鍵等作用［11］，使染料、藥物等分子結(jié)合到氧化石墨烯表面.同時(shí)，靜電吸附對(duì)此結(jié)合過程也有影響，在pH7.33的PBS緩沖環(huán)境下，氧化石墨烯表面豐富的羧基將電離而帶負(fù)電荷，而亞甲藍(lán)電離成正離子，靜電吸附進(jìn)一步提高了氧化石墨烯對(duì)亞甲藍(lán)的結(jié)合量.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以GO為載體，MB為模型分子，采用紫外分光光度法考察GO結(jié)合MB的含量，靜態(tài)吸附試驗(yàn)表明GO對(duì)MB的最大結(jié)合量為204.734mg/g.該研究為GO結(jié)合具有紫外吸收的藥物分子或各種功能分子提供了定量方法.

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