【作者】劉成虎，吳平，施燕平

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，濟南，250101

隨著越來越多與血液接觸的醫(yī)療器械在臨床上的使用，大量用于制造該類醫(yī)療器械的固體生物材料被不斷地開發(fā)和應用，并取得了良好的臨床使用效果。與此同時，人們對這些生物材料的血液相容性的重視程度也在不斷地提高。我們知道，補體是存在于人或脊椎動物血清與組織液中的一組不耐熱的、經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，補體激活是宿主的一種重要防御機制[1,2]。然而，固體生物材料及相應血液接觸類醫(yī)療器械激活補體也可能對宿主產(chǎn)生損害或?qū)е箩t(yī)療器械使用的失效[3,4]，如補體活化釋放的C3a和C5a進入血液可導致血管擴張、中性粒細胞聚集及過敏反應；又如C3b可吸附于生物材料的表面，促進血小板活化因子的釋放，引起血小板聚集，導致血栓形成。而且，激活的血小板又能通過經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)，從而使血栓形成的趨勢加劇[5]。另外一些固體生物材料中的外源性蛋白，則可誘導產(chǎn)生與人類蛋白交叉反應的IgG或IgM抗體，通過激活補體系統(tǒng)導致組織損傷。因此，本文就固體生物材料對血清補體的激活作用機制以及相關(guān)國際標準的最新要求進行介紹，有助于我們更好地開發(fā)和使用固體生物材料及相應血液接觸類醫(yī)療器械。

1 固體生物材料補體激活的途徑

固體生物材料與血液接觸以后，可以通過以下兩條途徑激活機體的補體系統(tǒng)（見圖1）。一是經(jīng)典途徑的補體激活，即固體生物材料與血漿中的免疫球蛋白形成抗原-抗體復合物，依次激活C1、C4、C2，形成C3轉(zhuǎn)化酶（C4b2b）；后者可活化C3，并形成C5轉(zhuǎn)化酶（C4b2b3b）；C5轉(zhuǎn)化酶可活化C5，并依次結(jié)合C6～C9,最終形成膜攻擊復合物（MAC），從而發(fā)揮補體的生物學作用。如使用聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）就可發(fā)生這種途徑的補體激活。二是固體生物材料表面的側(cè)鏈基團，如羧基、氨基等可與C3分子的磺酸酯基團共價結(jié)合，并為補體激活提供接觸表面，在血液中的B因子和D因子的作用下，形成C3轉(zhuǎn)化酶（C3bBb）；后者可活化C3并形成C5轉(zhuǎn)化酶（C3bBb3b），最終也形成MAC。如使用硫酸纖維素可發(fā)生補體的旁路途徑激活。同時，因為不需要抗體參與，所以旁路途徑補體激活的時間要早于經(jīng)典途徑補體激活的時間。

2 國際標準中對與循環(huán)血液接觸器械適用補體試驗的新要求

圖1 固體生物材料的補體激活途徑Fig.1 Complement activation approach by solid biomaterial

我們知道，血液接觸類醫(yī)療器械臨床使用風險一般比較高，所以市場準入門檻也就比較高。我國將其歸為第三類醫(yī)療器械，即植入人體，用于支持、維持生命，對人體具有潛在危險，對其安全性、有效性必須嚴格控制的醫(yī)療器械。并且，該類器械產(chǎn)品的注冊技術(shù)審評工作，一律由國家醫(yī)療器械技術(shù)審評機構(gòu)執(zhí)行。不僅我國如此，美國、歐盟、日本等國對該類醫(yī)療器械安全性控制也非常嚴格。相關(guān)的國際標準要求也在不斷地更新。ISO 10993系列標準中醫(yī)療器械生物學評價 第4部分：與血液相互作用試驗選擇（GB/T 16886.4）在2006年發(fā)布該部分標準的修改單[ISO 10993-4:2002/Amd.1:2006(E)][6]在修改單中增加了適用補體試驗的與循環(huán)血液接觸器械的種類，并將其與溶血、血栓形成、凝血一起列為血液接觸類醫(yī)療器械血液相容性評價的重要指標，進一步強調(diào)了該試驗在醫(yī)療器械血液相容性評價中的重要地位（見表1，表2）。

表1 與循環(huán)血液接觸器械部件（外部接入器械）Tab.1 Circular blood Contacting medical devies(extrinsic)

表2 與循環(huán)血液接觸器械部件（植入器械）Tab.2 Circular blood Contacting medical devies(embedded)

從表1和表2中可以看出，新版國際標準對與血液接觸時間較長和接觸程度較高的器械，基本上都列入了補體激活試驗的要求，這符合該類醫(yī)療器械生物安全性評價的發(fā)展趨勢。雖然ISO 10993系列標準的本部分適用于成品醫(yī)療器械，但這同時也彰顯出對固體生物材料及相應血液接觸類醫(yī)療器械補體激活作用研究的重要性。

3 如何選用固體生物材料補體激活作用的標準

目前，國際上還沒有統(tǒng)一、認可的檢測固體生物材料及相應醫(yī)療器械補體激活作用的實驗方法學標準。雖然國內(nèi)外實驗室中用于固體生物材料補體激活作用檢測的方法很多，但大多只限于從補體活性片段數(shù)量的角度來分析，沒有涉及到補體的功能檢測，并且實驗成本一般比較高，同時在可靠性、重現(xiàn)性和預示臨床性能方面尚存缺陷。因此，有必要對補體激活試驗標準及如何選用這些標準進行介紹，為固體生物材料補體激活作用的檢測提供新的思路。

3.1 通過補體關(guān)鍵分子數(shù)量來檢測補體激活作用

固體生物材料及相應的醫(yī)療器械與血液接觸后，如激活補體，首先表現(xiàn)出來的是血清補體關(guān)鍵分子的改變，如C3數(shù)量的減少，GB/T 14233.2-2005中提供了相應補體分子的檢測方法。該標準通過與對照組相比，體外檢測血清補體活化期間所形成C3a的量來判定醫(yī)療器械對人血清補體激活情況，從而推斷醫(yī)療器械的補體激活潛能[7]。其它可用于檢測的補體分子還包括C5a、Bb和C4d等。目前，人們已經(jīng)開發(fā)出各種商品化的試劑盒，來針對這些補體分子的檢測，因此操作十分方便，且適用于多種固體生物材料和相應醫(yī)療器械補體激活潛能的檢測。但如果想深入了解固體生物材料的補體激活作用，還需進一步分析補體的功能。

3.2 通過血清總補體功能變化來檢測補體激活作用

3.2.1 CH50

血清總補體功能活性的改變，可直觀地反映固體生物材料及相應醫(yī)療器械的補體激活作用。因此，總補體功能活性的檢測可用作補體激活試驗的常規(guī)篩選試驗。CH50是測定血清總補體活性的最簡單的方法，它的降低可表明血清總補體的消耗[8]。雖然實驗室常通過觀察CH50的改變來判定血清總補體的活性，但該項試驗的特異性不高，且易受環(huán)境和操作者的影響，因此一般不推薦將其用于固體生物材料補體激活作用的篩選。

3.2.2 ASTM F 1984-99

美國材料協(xié)會于1999年發(fā)布了一個簡單、廉價的用于測定固體生物材料對血清總補體的功能性體外激活作用的技術(shù)規(guī)范，即ASTM F 1984-99[9]。該規(guī)范主要包括兩個步驟：步驟A中將固體材料與標準數(shù)量的人血清接觸；步驟B中通過檢測補體介導的綿羊紅細胞裂解情況，測定接觸血清內(nèi)總補體的顯著功能性缺失。

ASTM F 1984-99可用于多種生物材料補體激活作用的檢驗，如醋酸纖維素、乳膠等。該規(guī)范雖然從功能上檢驗了固體生物材料補體激活的情況，但是在激活機制上不能區(qū)分是經(jīng)典途徑激活還是旁路途徑激活。事實上，微量激活物仍可能產(chǎn)生足量的裂解產(chǎn)物（C3a、C5a等），產(chǎn)生局部炎癥反應，但卻不會引發(fā)總補體活性的顯著改變。所以，該規(guī)范推薦的檢測方法對微弱補體激活物的敏感性不足，不適用于一些弱補體激活作用的固體生物材料，故需將獲得的結(jié)果與其它的試驗結(jié)果結(jié)合考慮，如旁路途徑的補體激活，共同評定試驗材料的補體激活特性。

3.3 其他補體激活試驗的選擇

3.3.1 ASTM F2065-00

固體生物材料及相應器械與血液接觸后，最先被激活的補體通路為旁路途徑。因此，旁路途徑激活對植入器械或外部接入血液器械用固體生物材料的篩選有重要意義。ASTM F2065-00就是一種評價固體生物材料旁路途徑補體激活潛能的方法[10]。該規(guī)范的步驟A是將固體生物材料與標準量的C4缺失的豚鼠血清[C4（-）GPS]接觸；步驟B則是通過檢測補體介導的兔紅細胞裂解情況，來分析接觸血清中功能性補體的活性。

C4（-）GPS不支持經(jīng)典途徑補體激活，因此ASTM F2065-00是固體生物材料旁路途徑補體激活的特異性試驗，特異性和敏感性都優(yōu)于總補體活性的檢測，故適用于篩選多種固體生物材料及相應醫(yī)療器械的補體激活特性。但與此同時，ASTM F2065-00中未涉及補體激活后具體效應分子的免疫功能，因此它也不是評價所有固體生物材料補體激活潛能最敏感和最特異的方法。如需要對單個補體裂解產(chǎn)物（如Bb和C4d等）進行免疫分析，還宜考慮生物材料對補體蛋白的非特異性吸附或通路激活[11]。

3.3.2 體內(nèi)補體激活試驗

除了體外補體激活試驗，過去人們還常用免疫化學法來定量分析體內(nèi)補體激活所產(chǎn)生的補體片段，進而評定補體激活作用。最近，Martin[12]等還應用特異性單克隆抗體法來研究體內(nèi)補體激活時所產(chǎn)生的補體片段，并取得了較好的結(jié)果。但是，鑒于血漿補體分子的多樣性，且這些補體分子在體內(nèi)條件下又會被迅速代謝，更增加了體內(nèi)補體激活試驗的復雜性。因此，目前還不推薦將其用于固體生物材料及相應醫(yī)療器械補體激活潛能的檢測。

4 結(jié)語與展望

多年來，血清補體激活作用一直是固體生物材料血液相容性研究的熱點領(lǐng)域。國際標準ISO 10993-4中也將補體活性產(chǎn)物的檢測，列入評價血液接觸類醫(yī)療器械血液相容性的一部分。然而，目前人們對固體生物材料的補體激活作用的認識還有許多不足之處，具體表現(xiàn)在：（1）目前用于檢測固體生物材料補體激活的方法眾多，且不統(tǒng)一，因此缺乏相應的行業(yè)標準來規(guī)范該項要求；（2）因為現(xiàn)有的ISO 10993系列標準對某些生物可降解材料、納米材料以及組織工程產(chǎn)品評價的不適用性，對這些材料的補體激活作用研究乃至血液相容性的評價將如何進行？（3）補體激活一般為急性期反應，但是慢性局部補體激活對醫(yī)療器械正常功能發(fā)揮的影響及具體機制還不明確；（4）其他形態(tài)的生物材料及相關(guān)器械中的添加劑、加工助劑等對補體的激活機制是什么？如Lamba 等[13]在體外研究醫(yī)用聚氯乙烯（PVC）對接觸血液影響時就發(fā)現(xiàn)，PVC中溶出的增塑劑DEHP是一種較強的補體激活劑，可激活補體產(chǎn)生C3a。雖然以上問題還有待進一步的研究和確認，但是我們有理由相信，隨著生物材料和分子生物學的不斷發(fā)展，對生物材料的補體激活機制的研究將會日趨成熟。

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