呂 英，劉家福，鄭世民*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

益生素（Probiotic）又稱(chēng)微生態(tài)制劑或活菌制劑，是一類(lèi)活性微生物添加劑。是從動(dòng)物或自然界分離、鑒定或通過(guò)生物工程人工組建的有益微生物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥、加工等特殊工藝制成的含有活菌并用于動(dòng)物的生物制劑或活菌制劑。畜禽應(yīng)用益生素后，能夠改善腸道微生態(tài)環(huán)境，正常情況下，腸道內(nèi)絕大多數(shù)為固有性菌群（如腸桿菌、鏈球菌和乳桿菌等），極少量為其他菌群（如葡萄球菌、嗜血桿菌等）。益生素能在消化道特別是腸道內(nèi)發(fā)育、繁殖并發(fā)揮有益作用，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料轉(zhuǎn)化率[1-2]，降低幼畜幼禽死亡率，防止消化道疾病，提高機(jī)體免疫力；作為新型綠色添加劑的益生素，由于其無(wú)殘留、無(wú)污染以及不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，有其獨(dú)特的優(yōu)越之處，因而益生素已成為很有前途的新型飼料添加劑。隨著人們食品安全意識(shí)的不斷提高，微生態(tài)制劑以其高效的保健功能、無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、不環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)成為替代抗生素較為理想的產(chǎn)品[2-3]。

本試驗(yàn)應(yīng)用酸性非特異性酯酶染色法系統(tǒng)地研究了雛雞飼喂益生素后，其免疫器官細(xì)胞免疫動(dòng)態(tài)變化，旨在揭示益生素對(duì)雛雞免疫器官的細(xì)胞免疫增強(qiáng)效果，為益生素在畜禽飼喂中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1日齡健康羅曼褐雛雞150只，購(gòu)自哈爾濱某孵化場(chǎng)。

1.1.2 益生素

益生素Ⅰ：廣州市希普生物飼料有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為粵飼添字（2001）031002號(hào)，主要成分乳酸菌、雙歧桿菌和酵母菌。活菌數(shù)＞1010cfu·mL-1，按產(chǎn)品說(shuō)明使用。

益生素Ⅱ：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院病理教研室研制。主要成分為乳酸菌和雙歧桿菌?；罹鷶?shù)＞1010cfu·mL-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物處理

1日齡羅曼褐商品公雞雛150只，隨機(jī)分為四組：即益生素Ⅰ組（簡(jiǎn)稱(chēng)PⅠ組，50只）、益生素Ⅱ（簡(jiǎn)稱(chēng)PⅡ組，50只）、對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)C組，50只）。PⅠ和PⅡ組雛雞于1日齡分別連續(xù)灌服益生素Ⅰ或益生素Ⅱ稀釋液3 d，每天1次，C組同時(shí)灌服生理鹽水。三組雛雞嚴(yán)格隔離，分別飼養(yǎng)。

1.2.2 檢測(cè)材料采取

PⅠ、PⅡ、C組雛雞于應(yīng)用益生素后1、4、7、10、18 d，每組隨機(jī)抽取相同數(shù)量雛雞心臟采血處死，快速采取免疫器官胸腺和脾臟，并作相應(yīng)處理后低溫保存?zhèn)錂z。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

免疫器官T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)-組織切片及酸性非特異性酯酶染色法（ANAE）用100×10油鏡，每張涂片查200個(gè)相應(yīng)器官細(xì)胞，計(jì)數(shù)TANAE+淋巴細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)用益生素雛雞胸腺T細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化

結(jié)果見(jiàn)表1。

雛雞應(yīng)用益生素后，其胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)T細(xì)胞數(shù)量均不同程度高于對(duì)照雛雞，于4～10 d差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明益生素能夠增強(qiáng)胸腺的細(xì)胞免疫，并在飼喂后4～10 d作用明顯。益生素Ⅰ組又不同程度高于益生素Ⅱ組，于7 d差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明益生素Ⅰ的免疫增強(qiáng)效果強(qiáng)于益生素Ⅱ，益生素Ⅰ是商品益生素，菌種包被較好，菌種相對(duì)益生素Ⅱ數(shù)量較多，這可能都是其效果較好的原因。胸腺是雞的中樞免疫器官，從結(jié)果可以看出，雛雞在發(fā)育過(guò)程中，胸腺中T細(xì)胞不斷發(fā)育成熟，細(xì)胞免疫逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明雛雞在生長(zhǎng)的過(guò)程中，免疫系統(tǒng)不斷完善。同時(shí)，可看出，益生素能夠促進(jìn)免疫器官胸腺的成熟，能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫。

2.2 應(yīng)用益生素雛雞脾臟T細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 雛雞應(yīng)用益生素后胸腺T細(xì)胞數(shù)量變化Table 1Change of T cells number in thymus of the probiotics fed chickens（103·m-2）

表2 雛雞應(yīng)用益生素后脾臟T細(xì)胞數(shù)量變化Table 2 Change of T cells number in spleen of probiotics fed chickens

雛雞應(yīng)用益生素后，其脾臟T細(xì)胞數(shù)量均不同程度高于對(duì)照雛雞，其中紅髓和動(dòng)脈周?chē)瘦^對(duì)照雛雞于4～10 d差異顯著或極顯著（P＜0.05或 P＜0.01），淋巴小結(jié)于 7、10 d差異顯著（P＜0.05）；說(shuō)明益生素能夠增強(qiáng)脾臟的細(xì)胞免疫，并在飼喂后4～10 d作用明顯。同時(shí)益生素Ⅰ組又不同程度高于益生素Ⅱ組，紅髓和動(dòng)脈周?chē)视? d差異顯著（P＜0.05），其他未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明增強(qiáng)脾臟細(xì)胞免疫的效果，益生素Ⅰ強(qiáng)于益生素Ⅱ。商品益生素可能由于其工藝成熟，所以免疫增強(qiáng)效果強(qiáng)于自制益生素。

3 討論與結(jié)論

胸腺是禽類(lèi)的中樞免疫器官，是骨髓多能干細(xì)胞繁殖、分化為成熟T細(xì)胞的場(chǎng)所，成熟T細(xì)胞進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至脾臟等其他淋巴器官組織；脾臟作為禽類(lèi)最大的外周免疫器官，對(duì)血液中循環(huán)抗原發(fā)揮免疫應(yīng)答，免疫器官功能正常與否和機(jī)體全身免疫狀態(tài)密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞主要承擔(dān)動(dòng)物有機(jī)體的細(xì)胞免疫，因此，其功能和數(shù)量異常直接影響著細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，雛雞應(yīng)用益生素后，無(wú)論是中樞免疫器官—胸腺，還是外周免疫器官—脾臟的T細(xì)胞數(shù)量均較相應(yīng)未飼喂益生素的對(duì)照雛雞明顯增加，表明益生素可增加免疫器官T細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫水平。益生素Ⅰ組雛雞的T細(xì)胞數(shù)量增加較益生素Ⅱ組雛雞更加明顯，說(shuō)明益生素Ⅰ的細(xì)胞免疫增強(qiáng)效果強(qiáng)于益生素Ⅱ，這是因?yàn)橐嫔丌裰谱鞴に嚲际蛊涫橙牒笕杂写罅炕罹嬖?，體內(nèi)有益菌群多于益生素Ⅱ，大量有益菌能夠增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)抗原刺激的反應(yīng)性。Harsharnjit等報(bào)道，長(zhǎng)期服用益生素可減少胃腸道感染，因其有益菌不僅起到機(jī)械性防御作用，還會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答作用[4]。姚淑蘭等發(fā)現(xiàn)，添加EM菌寶和加酶益生素不但均可顯著提高貴妃雞對(duì)粗蛋白的利用率，而且可顯著增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，說(shuō)明免疫水平增強(qiáng)[5]。石寶明等研究了基礎(chǔ)日糧中添加益生素對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能和腸道菌群的影響[6]。結(jié)果表明，益生素能夠促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，增強(qiáng)機(jī)體抵御疾病能力。Leuschner等研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)劑量及菌種的益生素，可提高動(dòng)物機(jī)體整體狀態(tài)和免疫水平[7]。Simone報(bào)道，乳酸桿菌能誘發(fā)Peyer氏淋巴結(jié)和全身（脾、外周血）的細(xì)胞免疫反應(yīng)[8]。蔡訪勤報(bào)道，酸性乳酸桿菌和嗜熱性鏈球菌能促進(jìn)脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞對(duì)Con A的增殖反應(yīng)，提高巨噬細(xì)胞的C3b受體活性，增強(qiáng)其抗腫瘤作用[9]。Inooka研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌能顯著提高仔雞脾臟T淋巴細(xì)胞比例，增強(qiáng)雞細(xì)胞免疫功能[10]。Karimi等報(bào)道，益生素能夠改善動(dòng)物腸道菌群平衡狀態(tài)，提高機(jī)體免疫應(yīng)答功能[11]。現(xiàn)已證實(shí)益生素能夠產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有益的物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物健康有益，已有許多微生態(tài)制劑被普遍認(rèn)可為完全安全的。

[1]王嶺,單安山.果寡糖對(duì)肉仔雞腸道菌群及生產(chǎn)性能的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(1)∶43-47.

[2]李有業(yè),徐占紅.養(yǎng)禽業(yè)用高效復(fù)方益生素添加劑[J].江西飼料,2009(3)∶13-14.

[3]李子平,靳月生,田樹(shù)飛.益生素在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(4)∶50-51.

[4]Harsharnjit S,Gill H S.Probiotics to enhance anti-infective defenses in the gastrointestinal tract[J].Best Pract Res Clin Gas troenterol,2003,17(5)∶755-773.

[5]姚淑蘭,張愛(ài)忠,姜寧,等.益生素對(duì)育成期貴妃雞養(yǎng)分利用率、血清生化指標(biāo)及腸道微生物區(qū)系的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2009(5)∶113-115.

[6]石寶明,單安山,劉海,等.寡聚糖、抗生素、益生素對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能和腸道菌群影響的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(4)∶204-206.

[7]Leuschner R G,Bew J,Simpson P J,et al.Enumeration of probiotic pediococci in animal feed∶inter laboratory study[J].JAOAC Int,2003,86(4)∶791-801.

[8]SimoneD.Microflora,yogurtandtheimmunesystem[J].IntJImmunother,1986(11)∶191.

[9]蔡訪勤,薛樂(lè)勛,羅豫,等.口服乳酸桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫功能及正常菌群的影響[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,1989,1(1)∶25-29.

[10]Inooka S.The effect of Bacillus natto feed on the T and B lymphocytes from spleen of feeding chickens[J].Poultry Sci,1986,65∶17-21.

[11]Karimi O,Pena A S.Probiotics∶Isolated bacteria strain or mixtures of different trains[J].Drugs Today(Barc),2003,39(8)∶565-597.