高明春，李雪萌，張潤祥，王君偉

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030）

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）是一類非特異性磷酸單酯酶，可催化磷酸單酯的水解[1]。AP廣泛存在于多種細菌、真菌及動物中。不同來源AP的分子質量大小、編碼序列差異很大，而且各物種AP的性質、結構、功能與催化機理也不盡相同[2-3]。在這其中，大腸桿菌AP（Escherichia coli alkaline phosphatase，EAP）的有關研究最為透徹。EAP由ρhoA基因編碼，為同源二聚體金屬酶，單體由449個氨基酸組成，分子質量為47 ku，活性中心包括3個金屬離子[4]。因EAP催化機理明晰，底物范圍廣泛，目前被作為信號酶而廣泛應用于醫(yī)學、免疫學和分析生物技術領域[5-6]。大腸桿菌ATCC 25922無致病性和耐藥基因，在生物研究領域通常將其作為對照用標準大腸桿菌模式菌株[7-9]，但ATCC 25922 EAP的研究未見報道，其分子序列與酶活性等均屬未知，本研究克隆并表達了來自大腸桿菌菌株ATCC 25922的EAP成熟肽基因，并對其進行了純化以及功能研究，以期為ATCC 25922 EAP的研究與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和試劑

大腸桿菌菌株E.coli ATCC 25922、克隆宿主菌TG1為本室（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物與免疫教研室）保存；純品GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白（即EAP N端融合有抗鵝γ干擾素單鏈抗體的重組蛋白）本室制備并保存；表達宿主菌RosettaTM（DE3）pLysS、原核表達載體 pET-30a（+）購自Novagen公司；pMD18-T-simple、T4DNA連接酶、限制性內切酶購于大連寶生物工程有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、堿性磷酸酶底物對硝基苯磷酸（pNPP）購自美國Amresco公司。

1.1.2 引物

參照E.coli K12的ρhoA基因序列（Accession NO.CP000948.1），使用Primer Premier5設計并合成用于擴增EAP成熟肽基因的引物，即EAP1 5'GCAGGATCCCGGACACCAGAAATG 3'與EAP2 5'GAGCCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGA 3'，分別帶有Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 EAP的克隆

按照細菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）說明書操作，提取ATCC 25922基因組，并以此為模板，克隆EAP基因。PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T-simple載體連接后轉化入TG1，在Amp平板上挑選單菌落活化后提取質粒，酶切及PCR鑒定正確后，委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA測序服務。

重組表達載體pET-30a-EAP的構建及鑒定參照文獻[7]進行，將連接在T載體上的EAP基因以Bam HⅠ、XhoⅠ消化下來并回收純化，與相同酶切回收的pET-30a連接，轉化TG1后涂布Kan抗性平板進行篩選，提取質粒進行酶切及PCR鑒定。

1.2.2 EAP基因表達與可溶性分析

將鑒定正確的pET-30a-EAP轉化入Rosetta（DE3），按1%的比例接種陽性菌液至含有200 mL LB的培養(yǎng)瓶，然后置于30℃220 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，在菌液OD600約為0.4時加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。取1 mL誘導后的菌液離心后進行SDS-PAGE分析。另取10 mL菌液離心、超聲波處理后上清液用于蛋白可溶性分析。剩余菌液離心后將濕菌儲存于-70℃冰箱備用。

1.2.3 rEAP純化流程

取前一步誘導后的濕菌重懸于20 mL的NPB緩 沖 液（Native purification buffer， 50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl），4℃5 000 r·min-1離心15 min后再重懸于12 mL NPB，反復凍融3次后在冰浴環(huán)境中超聲破碎菌體，8 000 r·min-115 min離心后，上清組分用于可溶性rEAP蛋白純化。將細菌裂解液上清7 mL過濾后加入柱式Ni-NTA純化系統(tǒng)（Invitrogen，1 mL填料），采用說明書所載的正常條件下的pH梯度洗脫方式并稍作改進對可溶性rEAP進行純化。菌體裂解液與Ni-NTA作用1 h后，以Buffer A～D（即將NPB pH分別調至8.0、7.2、6.6和5.3）進行洗滌，每次2 mL，每種溶液各洗滌 2 次；Buffer E～G（100 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1KCl，pH 分別為 4.2、3.7、3.3和3.0）進行洗脫，每次1 mL，每種溶液洗脫3次；最后用4 mL的0.01 mol·L-1NaOH洗柱2次，每次2 mL。對各級洗滌與洗脫液進行SDS-PAGE分析，并用Bradford法對蛋白進行定量。

1.2.4 rEAP酶促反應特性

1.2.4.1 濃度對rEAP催化速率的影響

取空白酶標板一塊，室溫下每孔添加pNPP顯色底物溶液（50 mg·L-1pNPP，1 mmol·L-1MgCl2溶于0.1 mol·L-1二乙醇胺緩沖液（pH 9.8））50 μL，然后分別按以下體積添加純化的rEAP：0、32、16、8、4、2、1、0.5 μL，去離子水將每孔補齊至 100 μL。室溫反應20 min后，每孔添加 50 μL 3 mol·L-1NaOH終止反應，并用酶標儀測定此時的OD405nm。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性試驗

將EAP置于100℃水浴10 min，恢復室溫后靜置30 min，再按1.2.4.1條件進行試驗。

1.2.4.3 rEAP N端定向標記多肽的酶促反應

純品GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白，按物質的量濃度折算為與1.2.4.1中EAP相當?shù)臐舛?，進行pNPP顯色反應，評估N端融合多肽對ATCC 25922 EAP催化能力的影響。

1.2.4.4 溫度對酶促反應動力的影響

將1.2.4.1的反應溫度分別改為25、37、50、56和65℃，其他條件不變進行顯色試驗。1.2.5 DNA去磷酸化試驗

從瓊脂糖凝膠回收Bam HⅠ酶切后的pET-30a（+）載體，分別用或不用 rEAP（0.35 mg·mL-1）去磷酸化，并轉化入100 μL TG1。計數(shù)平板上菌落數(shù)，以評估rEAP對DNA去磷酸化的效果。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌菌株ATCC 25922 EAP成熟肽基因的克隆與鑒定

EAP成熟肽基因克隆入pMD18-T-simple載體后，酶切驗證結果如圖1所示。pMD18-T-simple-EAP經(jīng)XhoⅠ單酶切，片段長為4.1 kb。該載體經(jīng)XhoⅠ、Bam HⅠ雙酶切，得到1.4和2.7 kb兩個片段。測序結果表明克隆的該基因為ATCC 25922株大腸桿菌EAP成熟肽基因。

2.2 表達載體pET-30a-EAP的酶切與PCR鑒定

表達載體pET-30a-EAP經(jīng)XhoⅠ或Bam HⅠ單酶切后得6.8 kb的片段，XhoⅠ和Bam HⅠ雙酶切后，得到5.4和1.4 kb兩個片段。PCR產(chǎn)物應出現(xiàn)1.4 kb左右片段。如圖2所示，電泳結果與預期相符。

圖1 酶切鑒定pMD18-T-EAPFig.1 Identification of pMD18-T-EAP with restriction enzyme

圖2 pET-30a-EAP的酶切及PCR鑒定Fig.2 Identification pET-30a-EAP with restriction and PCR

2.3 EAP蛋白的可溶性分析

如圖3所示，重組菌IPTG誘導后在預期位置可觀測到明顯的蛋白表達條帶，而對照菌卻沒有。重組EAP的表達量在28%左右，并且絕大部分產(chǎn)物為可溶性表達。

圖3 EAP蛋白表達的SDS-PAGE分析Fig.3 Detecting EAP expressed product with SDS-PAGE

2.4 rEAP蛋白純化工藝研究

對可溶性rEAP進行pH梯度洗脫法的金屬親合層析純化，結果如圖4所示。pH低于4.2時，EAP開始與親合基質解離，此時某些雜質蛋白也被洗脫，至pH 3.7之后的組份較為純凈，光密度掃描分析表明純度均在93%之上。按此方法純化，每升培養(yǎng)物可獲得290 mg純品rEAP，回收率為40%。

2.5 EAP活性分析

2.5.1 rEAP、EAP標記蛋白的反應速率及熱穩(wěn)定性試驗

rEAP可催化對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）產(chǎn)生黃色對硝基酚，并且煮沸后重新復性的rEAP催化特性沒有明顯改變，而EAP與其他蛋白融合后反應性能略有下降（見圖5）。

2.5.2 溫度對酶促反應動力性質的影響

如圖6所示，rEAP在25～65℃之間的催化性能均良好，且隨反應溫度升高酶活性顯著升高，65℃時的活性約為25℃時的4倍。

2.5.3 rEAP的DNA去磷酸化試驗

rEAP處理DNA前后的自連轉化結果如圖7所示。去磷酸化比未去磷酸化平板的自連轉化子數(shù)量顯著減少，表明重組子rEAP具有顯著的移除DNA 5'端游離磷酸基團的能力。

圖4 Ni-NTA親和層析純化EAP蛋白Fig.4 Recombinant EAP purification by affinity chromatography

圖5 重組EAP、EAP融合蛋白濃度與反應速率及熱穩(wěn)定性試驗Fig.5 Concentration,reaction rate and thermal stability test of recombinant EAP and EAP fusion protein

圖6 溫度對酶促反應動力的影響Fig.6 Effect of temperature on the enzyme kinetics

圖7 重組EAP的DNA去磷酸化試驗Fig.7 DNA dephosphorylation test of recombinant EAP

3 討 論

近年，包括大腸桿菌K12在內的多株大腸桿菌的EAP基因得到克隆與活性研究[10-13]，而關于大腸桿菌標準菌株ATCC 25922的EAP基因的研究尚未見報道。本研究證實ATCC 25922 EAP具有典型的EAP酶活性。作為一個新的EAP成員，ATCC 25922 EAP功能的驗證，豐富了人們對EAP的存在菌株以及催化活性等有關知識的進一步了解。

大腸桿菌堿性磷酸酶作為工具酶，可在基因連接中介導DNA去磷酸化反應。在ELISA等免疫學檢測方法中作為信號分子也有廣泛的應用。目前市場常見的AP產(chǎn)品中，CIAP（牛小腸AP）活性最高，約為天然EAP的40倍左右[13]。與提純天然的CIAP相比，EAP具有成本低，熱穩(wěn)定性好，而且可以通過基因工程方法實現(xiàn)蛋白質的直接、定向標記等優(yōu)點。并且由于EAP的催化活性與結構關系明確，可以方便的通過定點誘變等方法來提高EAP的酶活性。在后續(xù)研究中，本實驗室擬將催化活性位點101位氨基酸D突變?yōu)镾，及對其他活性位點進行誘變[10-12]，以期獲得更高活性的rEAP。

本研究探索了重組ATCC 25922 EAP的純化工藝，所表達的rEAP幾乎全部可溶，并且具有典型AP酶活性。通過摸索金屬親和層析純化rEAP的條件，得到了純度達93%以上的rEAP，理論上每升LB培養(yǎng)基可得到290 mg的rEAP純品。rEAP的酶熱穩(wěn)定性良好，100℃作用10 min后仍可恢復完全的酶活性，所耐受的工作溫度范圍也較為寬泛（25～65℃），因而可滿足多種反應條件的需求。

本研究還證實rEAP具有作為標記酶或報告分子的潛力，并且可用于DNA去磷酸化反應，為ATCC 25922 rEAP作為免疫酶與信號酶的開發(fā)與應用提供了必要參考依據(jù)。

4 結論

本研究克隆并高效表達了E.coli ATCC 25922 EAP，初步探索了重組EAP的純化工藝、酶活特性及應用方向，為ATCC 25922 EAP的后繼開發(fā)與應用奠定了必要的基礎。

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