吳民耀,文瑞麗,師 紅,王昭暉,張耀君

(陜西師范大學(xué) a.西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室;b.生命科學(xué)學(xué)院,西安 710062)

φC31位點(diǎn)特異性整合酶系統(tǒng)研究進(jìn)展*

吳民耀a,b,文瑞麗b,師 紅b,王昭暉b,張耀君b

(陜西師范大學(xué) a.西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室;b.生命科學(xué)學(xué)院,西安 710062)

介紹了 φC31重組酶作用機(jī)制、φC31整合酶在基因治療及其轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研制中的應(yīng)用、φC31整合酶催化效率的影響因素,以及 φC31整合酶整合的安全性。實(shí)驗(yàn)證實(shí),φC31-int可作用于多種動(dòng)植物細(xì)胞及組織,將目的基因特異地整合到宿主基因組,使目的基因得以持續(xù)、高效地表達(dá)。近年來該酶在哺乳動(dòng)物體內(nèi)和體外的研究進(jìn)展表明,φC31整合酶已經(jīng)成為研究轉(zhuǎn)基因、基因治療及基因修飾的一種重要工具。

φC31整合酶;位點(diǎn)特異性重組;轉(zhuǎn)基因;基因治療

20世紀(jì) 70年代以來,生物工程的飛速發(fā)展使得基因重組技術(shù)越來越受到研究者的重視?；蛑亟M技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室條件下人工構(gòu)建或者修飾DNA,將重組 DNA分子引入受體細(xì)胞,并使之增殖和表達(dá)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因治療及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研制?；蛑亟M包括同源重組、位點(diǎn)特異性重組、非同源重組以及轉(zhuǎn)座重組。為了將構(gòu)建的DNA整合進(jìn)基因組,目前依靠的仍然是非同源重組的隨機(jī)整合,但整合位點(diǎn)的隨機(jī)性往往會(huì)導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定表達(dá)及潛在的突變,重則影響原癌基因或抑癌基因的表達(dá)失控。同源重組是非姐妹染色單體之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組反應(yīng)嚴(yán)格依賴DNA分子之間的同源性,比較準(zhǔn)確,但是重組率較低[1]。

近年來,位點(diǎn)特異性重組酶 (site-specific recombinases,SSRs)引起了科學(xué)家的重視,得到了廣泛的研究和應(yīng)用,成為修飾細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因以及基因治療領(lǐng)域的有力工具。

1 位點(diǎn)特異性重組酶

位點(diǎn)特異性重組是發(fā)生在 2條鏈特異位點(diǎn)上的重組,重組的發(fā)生需要一段同源序列,即特異性位點(diǎn)(attachment site,att)、位點(diǎn)特異性的催化因子即重組酶(integrases)及其輔助因子(cofactor)參與催化。有些重組酶系統(tǒng)只有位點(diǎn)特異性重組酶和特異位點(diǎn),而不需要其他輔助因子。重組酶只能催化該特異性位點(diǎn)間的重組,因此重組具有特異性和高度的保守性。

位點(diǎn)特異性重組酶家族根據(jù)序列的同源性及催化機(jī)制分為 2個(gè)家族：酪氨酸家族和絲氨酸家族。酪氨酸家族有λ重組酶、P1噬菌體的 Cre重組酶、酵母的 FLP轉(zhuǎn)位酶(invertase)及細(xì)菌的XerC蛋白等;絲氨酸家族有 φC31,Tn3,R4,TP901-1等。迄今發(fā)現(xiàn)的重組酶雖然已有幾百種,但得到廣泛應(yīng)用的只有酪氨酸家族的 In,t Cre,FLP和絲氨酸家族的 φC31。

2 φC31重組酶作用機(jī)制

絲氨酸重組酶家族中的鏈霉菌噬菌體 φC31整合酶由鏈霉菌噬菌體編碼,能識(shí)別噬菌體上 attP位點(diǎn)(phage attach m ent site)和宿主基因組 attB位點(diǎn)(bacterial attach m ent site)的介導(dǎo)特異性重組反應(yīng),從而將噬菌體 DNA整合到宿主的基因組中[2-3]。研究表明,φC31噬菌體上的 attP位點(diǎn)和宿主鏈霉菌基因組上 attB位點(diǎn)具有一定的同源性,而 attP和 attB最小活性序列長度分別為 39bp和 34bp。φC31整合酶分別從 39bp的 attP和 34bp的 attB序列的中心位置 TTG后的堿基開始切割雙鏈 DNA,旋轉(zhuǎn) 180°后再連接起來,形成 36bp的 a-t tL和 37bp的 attR。在沒有其他輔因子時(shí),attR和attL不再是整合酶的底物,單向插入了基因序列[4]。目前應(yīng)用較為廣泛的 Cre及 FLP重組酶介導(dǎo)的重組具有雙向性,從而導(dǎo)致可逆的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng),使得重組效率降低,所以 φC31整合酶是基因整合一個(gè)高效工具。

研究人員在果蠅、爪蟾、小鼠、大鼠、兔、牛、人、擬南芥、煙草、小麥等動(dòng)植物基因組多種生物基因組中發(fā)現(xiàn)一些與 φC31噬菌體有著同源性的基因序列,并證實(shí) φC31整合酶可識(shí)別此類序列,而且能介導(dǎo)與 attB位點(diǎn)的特異性重組。進(jìn)一步的研究從小鼠整合事件中鑒定出 57個(gè)假 attP位點(diǎn)。人類基因組大約有 370個(gè)假 attP位點(diǎn)。在人基因組假 attP位點(diǎn)分布的基因背景研究中,發(fā)現(xiàn)人基因組序列中假 attP位點(diǎn) 74.5%位于基因間, 24.4%位于基因內(nèi)含子,僅有1.1%位于外顯子中[5],該假 attP位點(diǎn)分布比例在實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。研究人員分別用帶有 attB及 attP的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)帶有 attB載體整合效率提高了 5～10倍。由于假 attP位點(diǎn)大多在基因組編碼序列之外,周圍無功能基因,因此外源基因在這些位點(diǎn)整合一般不影響宿主基因組及外源基因自身的表達(dá)[6],因此人們將帶有 attB序列載體于攜帶φC31整合酶整合酶基因的載體共轉(zhuǎn)染,使之在φC31整合酶作用下與假 attP特異性重組,從而將目的基因整合到哺乳動(dòng)物基因組中。

3 φC31整合酶在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研制及基因治療中的應(yīng)用

大量的研究表明,φC31整合酶可作用于多種細(xì)胞環(huán)境,包括果蠅、非洲爪蟾、斑馬魚以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。目前,φC31整合酶已成為轉(zhuǎn)基因、基因治療、基因靶向敲除及細(xì)胞系處理一個(gè)有效的工具,具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 φC31整合酶轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研制中的應(yīng)用

盡管人們對(duì) φC31整合酶系統(tǒng)的關(guān)注主要集中在基因治療方面,但是 φC31整合酶系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因方面的工作也起到發(fā)展的作用。

轉(zhuǎn)基因研制方面目前應(yīng)用最為廣泛的是原核顯微注射法,該方法可以使外源基因在染色體上隨機(jī)整合,外源基因整合率和表達(dá)率較低,往往影響了后期基因表達(dá)與調(diào)控研究。而 φC31整合酶系統(tǒng)與顯微注射技術(shù)結(jié)合大大提高了整合效率,并且可以將目的基因定點(diǎn)整合至所期待的染色體位置。

φC31整合酶被證明可作用于昆蟲基因組。研究者用果蠅 P因子在果蠅胚胎的基因組上隨插入一些 attP位點(diǎn),然后用 φC31整合酶的編碼mRNA和帶有 attB的質(zhì)粒進(jìn)行共同顯微注射,結(jié)果發(fā)現(xiàn) 46%的果蠅發(fā)生了轉(zhuǎn)基因,而且整個(gè)轉(zhuǎn)基因耗時(shí)較短,可用于其他轉(zhuǎn)基因的制作[7-8]。在蚊子當(dāng)中,φC31整合酶也可介導(dǎo)高效和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因[9],另外,該酶也被證明可以在桑蠶的細(xì)胞中發(fā)生作用[10]。最近,φC31整合酶正被選擇用于昆蟲基因組的快速和精確的操作。

φC31整合酶系統(tǒng)也被應(yīng)用于創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因爪蟾[11-12]效率可以高達(dá) 40%,使得該系統(tǒng)成為一種簡單而有效的爪蟾轉(zhuǎn)基因方法。近年來,研究者發(fā)現(xiàn) φC31整合酶可作用于斑馬魚細(xì)胞,且 φC31整合酶介導(dǎo)的整合效率高于 Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[13]。

研究者通過共注射 φC31整合酶的編碼mRNA和帶有 attB的質(zhì)粒 DNA到小鼠的胚胎中,檢測(cè)到該質(zhì)粒在假 attP位點(diǎn)上整合,且發(fā)現(xiàn) 2.6%的轉(zhuǎn)基因后代[14]。Belteki等[15]也通過制備攜帶φC31位點(diǎn)特異性整合酶系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞(ES cell)成功實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。φC31整合酶表達(dá)載體 pCMV-int和含有 attB序列的綠色熒光蛋白表達(dá)載體 pEGFP-N1-attB共同注射出生牛的成纖維細(xì)胞,所有的細(xì)胞克隆均表達(dá)綠色熒光蛋白,而且研究人員發(fā)現(xiàn)了 4個(gè) φC31整合酶所介導(dǎo)的整合熱點(diǎn)“H ot Spots”,證明該酶可以運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因牛的研究當(dāng)中[16]。φC31整合酶被證明可作用于人的胚胎干細(xì)胞,攜帶EGFP基因的 2種載體均成功整合到假的 attP位點(diǎn),并且在傳代后的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),沒有明顯的毒副作用,且能維持人的胚胎干細(xì)胞的多能性[17]。

在轉(zhuǎn)基因植物的研究中,φC31整合酶基因在模式生物擬南芥OXS3啟動(dòng)子的調(diào)控下刪除二倍體擬南芥基因組 attP側(cè)翼的靶向序列,并且證實(shí)這種刪除是保守的,從而說明 φC31整合酶是植物基因工程學(xué)一種有效的工具,可介導(dǎo)靶向基因的切除及轉(zhuǎn)基因[18]。此外,φC31整合酶被證明可作用于多種小麥品種基因組,并可穩(wěn)定地遺傳給子代[19]。在轉(zhuǎn)基因煙草的研制中,φC31整合酶介導(dǎo)基因的重組和靶基因的刪除[20-21]。

除了用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)以及染色體的操作, φC31整合酶也被證實(shí)可以用于創(chuàng)建重組蛋白高水平表達(dá)的細(xì)胞系。在 CHO細(xì)胞系中,φC31整合酶所介導(dǎo)的整合相對(duì)于隨機(jī)整合具有更高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)[22]。φC31整合酶是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗體-胞內(nèi)核糖體插入位點(diǎn)-復(fù)合蛋白整合及表達(dá)的一種有力的工具[23]?？梢?φC31整合酶可用于乳腺反應(yīng)器的研究,產(chǎn)生高水平表達(dá)蛋白質(zhì)。

3.2 φC31整合酶在基因治療中的應(yīng)用

φC31整合酶被發(fā)現(xiàn)可通過識(shí)別哺乳動(dòng)物基因組上假 attP位點(diǎn)作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以后, OlivaresE.C等人用高壓尾靜脈注射的方法將含有 attB位點(diǎn)的人凝血因子 IX(hu m an blood clotting factor I X,hFIX)表達(dá)載體和φC31整合酶表達(dá)質(zhì)粒一同注射到小鼠尾靜脈。結(jié)果表明,φC31整合酶可介導(dǎo) hFI X表達(dá)載體通過肝臟基因組內(nèi)生 attP位點(diǎn)整合到小鼠肝臟細(xì)胞。φC31整合酶存在的情況下, IX因子得以長期穩(wěn)定的表達(dá)。該研究也表明了 φC31整合酶在活體內(nèi)的整合異性可能會(huì)比在培養(yǎng)細(xì)胞中的高,而且表達(dá)更持久,甚至有些小鼠終身的表達(dá)都不發(fā)生改變[24]。

H eldP.K[25]等用帶有 FAH的 cDNA以 attB位點(diǎn)的質(zhì)粒和 φC31整合酶的表達(dá)質(zhì)粒共同高壓注射FAH缺陷型的小鼠尾靜脈以研究基因治療治療遺傳性酪氨酸血癥。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明整合酶介導(dǎo)的基因表達(dá)可長期表達(dá),甚至是在多次細(xì)胞分裂之后。

交界型大皰性表皮松解癥(junctional epidermolysis bullosa,JEB)是一組皮膚基底膜帶透明板處發(fā)生水皰和大皰的隱性遺傳疾病。用帶有 attB位點(diǎn)和篩選標(biāo)記的層粘連蛋白-5(lam inin 5)表達(dá)載體與 φC31整合酶共轉(zhuǎn)染來源于 JEB病人的JEB角質(zhì)細(xì)胞(JEB keratinocytes),篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞,并移植到免疫缺陷型小鼠體內(nèi)。用免疫組織化學(xué)法分析植入的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)它們并不能和正常的細(xì)胞所區(qū)別。被移植的皮膚細(xì)胞的完整性大約維持了 14周[26]。

Chalberg等[27]的研究表明,φC31整合酶具有治療視網(wǎng)膜遺傳疾病的潛能。含有 eGFP基因的質(zhì)粒 DNA注射入大鼠 retinal pigment epithelium (RPE)細(xì)胞當(dāng)中,并通過電擊使 DNA進(jìn)入細(xì)胞當(dāng)中。與 φC31整合酶共同注射的處理組在注射后48 h的 eGFP基因表達(dá)最強(qiáng),在 4.5個(gè)月后仍能檢測(cè)到其表達(dá),而且表達(dá)量是未加 φC31整合酶處理組的 85倍,表現(xiàn)出相當(dāng)強(qiáng)的基因整合及表達(dá)。

在關(guān)節(jié)疾病基因治療的研究中,φC31整合酶在人類滑膜細(xì)胞和兔膝關(guān)節(jié)滑膜中的作用使得標(biāo)記基因的表達(dá)明顯提高,所以 φC31整合酶可能是基因治療關(guān)節(jié)疾病的一種的方法[28]。

在肌肉疾病的研究中,將含有 attB位點(diǎn)的熒光素酶的表達(dá)載體和 φC31整合酶表達(dá)載體用活體肌肉注射入小鼠后肢脛骨前部肌肉中,接著用微電極插入注射部位附近電擊穿孔,使得質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞中。用生物體發(fā)光成像系統(tǒng)分析得出,在 φC31整合酶的作用下熒光素酶的表達(dá)提高了 5～10倍。而含有 attB位點(diǎn)得抗肌萎縮蛋白(dystrophin)表達(dá)質(zhì)粒載體用上述方法轉(zhuǎn)至小鼠肌肉細(xì)胞中,抗肌萎縮蛋白的靶向整合和高水平表達(dá)使得肌纖維得到了更好的保護(hù),減緩了肌肉萎縮[29]。

在人的血管疾病研究方面,用以上方法使得含有 attB位點(diǎn)的 VEGF的表達(dá)載體和 φC31整合酶表達(dá)載體DNA進(jìn)入細(xì)胞當(dāng)中,PCR結(jié)果證實(shí)位點(diǎn)特異性VEGF表達(dá)載體整合至肌肉組織細(xì)胞中常見的 φC31整合酶整合位點(diǎn)。結(jié)果表明,φC31整合酶整合系統(tǒng)可被用于治療外周血管類疾病[30]。

研究者將攜帶有熒光素酶基因和 attB位點(diǎn)的質(zhì)粒載體和可在小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞 mouse neural progenitor cells(mNPCs)中表達(dá) φC31整合酶得質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞核,檢測(cè)到熒光素酶可在mNPCs中長期且穩(wěn)定表達(dá),并且隨著細(xì)胞的增值和分化在神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),被認(rèn)為可用于神經(jīng)退行性疾病的基因治療[31]。

在小鼠肺泡 II型(MLE12)細(xì)胞中利用聚乙烯亞胺(Polyethylen im ine,PEI)-DNA復(fù)合物與編碼 φC31整合酶的載體共同注射到小鼠尾靜脈中。PEI-DNA復(fù)合物是將基因轉(zhuǎn)入肺的一種有效的方法。研究表明除了內(nèi)皮細(xì)胞外,肺泡 I型、II型細(xì)胞都可成功地轉(zhuǎn)染[32]。

4 φC31整合酶催化效率的影響因素

φC31整合酶的作用效率主要取決于酶的特異性構(gòu)象、底物的特性。

在多種生物種存在的與 attB序列具有同源性的 pseudo-attP位點(diǎn)的特性確保了定點(diǎn)整合的精確性。φC31整合酶識(shí)別假 attP位點(diǎn),介導(dǎo)目的基因整合從而獲得長期、穩(wěn)定的表達(dá)。一般認(rèn)為,pseudo attP位點(diǎn)一般存在于哺乳動(dòng)物染色體表達(dá)旺盛的區(qū)域,這些區(qū)域具有開放的染色體構(gòu)象,易于被φC31整合酶識(shí)別[6]。

轉(zhuǎn)染入細(xì)胞但并未整合的瞬間表達(dá)質(zhì)粒載體表達(dá)的衰減是由于質(zhì)粒中高水平的甲基化CpG和原核骨架序列導(dǎo)致質(zhì)粒基因沉默。啟動(dòng)子影響著轉(zhuǎn)基因表達(dá)的長久性,不同的組織有不同的整合效率是由于φC31整合酶對(duì)于不同組織基因的“可近性”。研究者用含有 EGFP和熒光素酶復(fù)合物基因的質(zhì)粒載體與 φC31整合酶瞬間表達(dá)載體共注射于小鼠尾靜脈。用半巢式 PCR檢測(cè)上述質(zhì)粒在肺泡細(xì)胞中的整合反應(yīng)表明在有熒光反應(yīng)的 15個(gè)整合產(chǎn)物中只有 7個(gè)整合于人們所描述的整合熱點(diǎn)(H ot spot)mpsL1位點(diǎn)上,其余可能整合于其他整合位點(diǎn),從而得出不同類型的細(xì)胞整合位點(diǎn)有所不同。研究者繼而用 phiC31整合酶mRNA轉(zhuǎn)染各種類型細(xì)胞發(fā)現(xiàn) φC31整合酶介導(dǎo)的重組產(chǎn)物表達(dá)水平各不相同,并發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能抑制φC31整合酶整合酶表達(dá)的抑制因子 DAXX,但是至于其他未知的的抑制因子還有待進(jìn)一步的探索[33]。

攜帶有核定位信號(hào)(nuclear localization signa,l NLS)的 φC31整合酶基因被證明在可進(jìn)入細(xì)胞核中介導(dǎo)整合反應(yīng),尤其是在不分裂的細(xì)胞中,如肺泡 I型 II型細(xì)胞,并且可以提高整合效率[34]。

實(shí)驗(yàn)證實(shí),載體骨架序列可影響 φC31整合酶介導(dǎo)的整合效率。用介導(dǎo) FAH基因整合到人基因組的研究表明,φC31整合酶可介導(dǎo)成功的整合,但是整合效率僅僅有 4%左右,從而推斷酶的性能可能需要提高。因此,要確定質(zhì)粒的骨架序列對(duì) φC31整合酶整合作用影響的確切作用機(jī)理,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[35]。為了提高 φC31整合酶的效率,研究人員突變處理了 φC31整合酶,并研究其作用于人類基因組內(nèi)生 attP位點(diǎn)和提前插入的 attP位點(diǎn)上的整合效率。研究結(jié)果表明,突變 φC31整合酶 P2具有野生型 φC31整合酶 2倍的染色體整合效率,而 P3介導(dǎo)的整合反應(yīng)可在小鼠肝臟中長時(shí)間表達(dá) hFI X,且表達(dá)時(shí)間是野生型 φC31整合酶介導(dǎo)反應(yīng)的 2倍。φC31整合酶的此類突變對(duì)基因改造和基因治療是有用的,而且表明改造 φC31整合酶以使之具有更好的性能是可行的[36]。

5 φC31整合酶整合的安全性

研究表明,基因組的改變可能影響正?；虻谋磉_(dá)或者激活原癌基因和抑癌基因,從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。任何整合系統(tǒng)來說都存在著插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。由于在染色體上具有 φC31整合酶所識(shí)別的特異性序列 attB,從而減少了隨機(jī)整合的程度。φC31整合酶的應(yīng)用大大改善了此類缺點(diǎn)。細(xì)胞水平研究表明,φC31整合酶介導(dǎo)的基因重組大部分還未發(fā)現(xiàn)插入任何位點(diǎn)靠近癌基因,只有10%的整合位點(diǎn)在培養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)染色體異常,這些異常事件也大多發(fā)生在大量存在于基因間非編碼序列及基因內(nèi)含子上的假 attP位點(diǎn)。哺乳動(dòng)物整合事件中,所鑒定到的整合熱點(diǎn)都不和癌基因接近,因此 φC31整合酶系統(tǒng)相對(duì)于隨機(jī)整合系統(tǒng)發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)非常小[6-5]。在哺乳動(dòng)物動(dòng)物體內(nèi)整合研究中,φC31整合酶介導(dǎo)的整合反應(yīng)還未發(fā)現(xiàn)與腫瘤或其它不利的結(jié)果。

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用當(dāng)中,φC31整合酶系統(tǒng)也未發(fā)現(xiàn)致病性,大量編碼 φC31整合酶的 mRNA被注射入爪蟾和果蠅的早期胚胎,結(jié)果并未導(dǎo)致子代存活率的下降或者提高子代的異常率。另外,用 φC31整合酶處理的小鼠胚胎干細(xì)胞而產(chǎn)生的小鼠可以正常得發(fā)育和繁殖,這些結(jié)果表明φC31整合酶在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)不具有很高的毒性。φC31整合酶在目前接受處理的組織當(dāng)中還沒有發(fā)現(xiàn)免疫原性的獲得。目前在運(yùn)用 φC31整合酶進(jìn)行基因改造的實(shí)驗(yàn)中,φC31整合酶基因都是位于瞬間表達(dá)載體上,并不整合于基因組上穩(wěn)定表達(dá),所以細(xì)胞毒性相對(duì)較小。更多檢驗(yàn) φC31整合酶免疫原性的工作正在進(jìn)行當(dāng)中[37]。

6 展望

φC31整合酶系統(tǒng)與病毒載體系統(tǒng)相比具有位點(diǎn)特異性、高效性、表達(dá)的長期性而且作用于染色體時(shí)無需其他輔助因子。基于 φC31整合酶系統(tǒng)的以上特性,φC31整合酶的應(yīng)用涉及到基因修飾、轉(zhuǎn)基因、基因治療等方向的研究。與其他常用的整合酶相比,φC31整合酶介導(dǎo)的重組反應(yīng)具有不可逆性,從而確保目的基因整合至基因組后不會(huì)再被刪除。φC31整合酶系統(tǒng)已經(jīng)較多的應(yīng)用于各種疾病的基因治療發(fā)面,而在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面的研究相對(duì)較少。該系統(tǒng)在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物尤其是動(dòng)物乳腺反應(yīng)器方面有較為廣闊的前景。φC31整合酶系統(tǒng)與顯微注射技術(shù)的配合將大大提高轉(zhuǎn)基因的效率和降低非特異性整合所帶來的染色體有害變異。隨著 φC31整合酶研究的深入,需要探索怎樣提高不同細(xì)胞和組織中 φC31整合酶作用效率。

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(責(zé)任編輯 劉 舸)

Research of φC31 Site-specific Integrase Syste m

WU M ing-yaoa,b,WEN Ru-i lib,SH IHongb,WANG Zhao-huib,ZHANG Yao-junb

(a.NationalEngineering Laboratory ofEndangeredmedicinal resources development in Northwest; b.College ofL ife Sciences,ShanxiNro malUniversity,X i'an 710062,China)

The actionm echani sm of φC31 integrase,its application in gene therapy and the research of transgenic an ima,l the affecting factors of its catalyzing efficiency and its safety are introduced in this paper.Exper imental events illum inated thatφC31 integrase brought out efficiency and stable expression of target gene ingration on genom ic of cells and tissue ofmanifold an im al and several plants. In recent years,research onφC31 integrase in vitro and in vivi ofmamm alians indicated thatφC31 integrase is a significant tool for transgenic research、gene therapy、gene modification.

φC31 integrase;site-specific recombinations;transgenic;gene therapy

book=7,ebook=1

Q81

A

1674-8425(2010)07-0030-07

2010-03-25

吳民耀(1963—),男,陜西興平人,德國慕尼黑大學(xué)博士,陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授,主要從事干細(xì)胞生物學(xué)、胚胎生物工程、基因工程方面的研究。